蛋白質(zhì)純化實驗技術(shù)服務(wù)

蛋白質(zhì)純化簡介:

蛋白純化要利用不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。每種蛋白間的大小形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來得到重組蛋白。

蛋白質(zhì)純化的實驗方法:

蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細(xì)純化階段二個階段。一般蛋白純化采用的方法為樹脂法。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細(xì)胞成分如DNA、RNA等分開，由于此時樣本體積大.成分雜，要求所用的樹脂高容量、高流速、顆粒大、粒徑分布寬.并可以迅速將蛋白與污染物分開，必要時可加入相應(yīng)的保護劑(例如蛋白酶抑制劑)。防止目的蛋白被降解。精細(xì)純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與那些分子量大小及理化性質(zhì)接近的蛋白區(qū)分開來，要用更小的樹脂顆粒以提高分辨率，常用離子交換柱和疏水柱，應(yīng)用時要綜合考慮樹脂的選擇性和柱效兩個因素。選擇性指樹脂與目的蛋白結(jié)

合的特異性，柱效則是指各蛋白成分逐個從樹脂上集中洗脫的能力，洗脫峰越窄，柱效越好。僅有好的選擇性，洗脫峰太寬，蛋白照樣不能有效分離。

蛋白的表達:

是指通過模式生物來表達目的的外源基因蛋白的一種現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，表達系統(tǒng)主要是由宿主、外源基因、載體和輔助

成分組成，從而實現(xiàn)外源基因通過載體在宿主中的表達。

實驗意義:

1.蛋白表達技術(shù)在基因工程技術(shù)中占有核心地位，在實際生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用意義。

2.蛋白表達技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個具體領(lǐng)域,特別是體內(nèi)的功能研究和蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)都需要應(yīng)用。

實驗原理:

1.獲得目的基因;

2.構(gòu)建合適的載體(注意根據(jù)目的基因和純化方式的選擇等多方面因素選擇融合標(biāo)簽) ;

3.將目的基因插入表達載體中。并通過測序進行驗證；

4.載體轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌等宿主菌后，測序篩選挑單克隆菌落進行擴大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)靶蛋白的表達；

5.破碎菌體后提取蛋白。并通過融合標(biāo)簽純化得到靶蛋白。

分類:

1.真核表達系統(tǒng):真核表達系統(tǒng)主要有昆蟲表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達，其中酵母表達和哺乳動物細(xì)胞較為常見。

2.無細(xì)胞體外表達系統(tǒng)，又稱為體外翻譯系統(tǒng)，通過模擬細(xì)胞的生命活動和現(xiàn)象來重現(xiàn)胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。

結(jié)果展示:

原核表達系統(tǒng)

真核表達系統(tǒng)

無細(xì)胞體外表達系統(tǒng)

Reaction temperature (C)

實驗周期及交付標(biāo)準(zhǔn):

1.實驗周期: 4-6周

2.交付標(biāo)準(zhǔn):目的蛋白、實驗報告(試劑、 耗材、實驗步驟)、原始數(shù)據(jù)等。

需確認(rèn)的信息:

1.表達系統(tǒng)采取方式。

2.純化步驟選擇。