梭狀芽孢桿菌是一種復(fù)雜的具有多樣性的細(xì)菌群，主要是由能形成孢子的革蘭氏陽(yáng)性、厭氧、桿狀細(xì)菌組成。梭狀芽孢桿菌在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)因肉毒梭菌（Clostridium botulinum）中毒、破傷風(fēng)梭菌（Clostridium tetani）感染和產(chǎn)氣芽孢梭菌（Clostridium perfringens）引起食物中毒等原因，被劃分在有害菌群中。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)等產(chǎn)生的有益代謝物，不僅可以推動(dòng)可再生能源相關(guān)主題研究的發(fā)展，還可以促進(jìn)腸道穩(wěn)態(tài)，保障人體健康。但梭菌的低轉(zhuǎn)化效率以及合成生物學(xué)工具和遺傳部件的匱乏使得梭狀芽孢桿菌屬進(jìn)行代謝工程非常困難。因此，隨著梭狀芽孢桿菌的關(guān)注度度越來(lái)越高，對(duì)成熟遺傳轉(zhuǎn)化方法的需求也越來(lái)越迫切^[1]。

復(fù)制子（Replicon）是復(fù)制質(zhì)粒的關(guān)鍵元件，它可以影響質(zhì)粒拷貝數(shù)和遺傳穩(wěn)定性，進(jìn)而對(duì)基因表達(dá)、宿主代謝和最終產(chǎn)物形成產(chǎn)生巨大影響。目前在梭菌的研究中主要選擇的方式是結(jié)合轉(zhuǎn)移，因此在載體設(shè)計(jì)上必須同時(shí)兼顧革蘭氏陰性復(fù)制子和革蘭氏陽(yáng)性復(fù)制子^[2]。本文主要介紹四種常見(jiàn)梭菌復(fù)制子在梭菌遺傳轉(zhuǎn)化中的歷史和作用。

在梭菌的研究上，1981年Minton等人從丁酸梭菌中分離并鑒定了具有復(fù)制功能的pCB102復(fù)制子； 1986年Monod等人從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中分離得到復(fù)制子pIM13； 1998年Davis等人從肉毒梭菌中分離并初步鑒定了pBP1的復(fù)制功能，隨后在2006年，Pennington等人發(fā)現(xiàn)pPB1在生孢梭菌（Clostridium sporogenes）中同樣具有復(fù)制功能。2002年Purdy等人從艱難梭菌（Clostridium difficile）中分離并鑒定到復(fù)制子pCD6。在已發(fā)現(xiàn)并得到的復(fù)制子基礎(chǔ)上，為使整個(gè)轉(zhuǎn)化體系更規(guī)范和統(tǒng)一，針對(duì)不同的復(fù)制子改造了不同的梭菌專(zhuān)用質(zhì)粒。如：質(zhì)粒PMTL82151的復(fù)制子是pBP1; 質(zhì)粒PMTL83151的復(fù)制子是pCB102；質(zhì)粒PMTL84151的復(fù)制子是pCD6；質(zhì)粒PMTL85151的復(fù)制子是pIM13^[3]。

為了解不同復(fù)制子和篩選抗性在不同梭菌中的作用，Heap等人在2009年采用具有不同復(fù)制子的質(zhì)粒和篩選抗性對(duì)肉毒梭菌、丙酮丁醇梭菌和艱難梭菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，在結(jié)合轉(zhuǎn)移的篩選過(guò)程中，主要選擇catP；ermB；aad9和tetA四種基因?qū)?yīng)抗生素，其中 catP和ermB的適用范圍相對(duì)更普遍(Table 5)。肉毒梭菌在帶有pBP1和pCB102復(fù)制子的轉(zhuǎn)化體系中，獲得陽(yáng)性克隆的效率遠(yuǎn)高于pCD6和pIM13。丙酮丁醇梭菌和艱難梭菌在轉(zhuǎn)化過(guò)程中對(duì)復(fù)制子的偏好并不顯著（Table 3）。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)丙酮丁醇梭菌在pBP1復(fù)制子體系下，穩(wěn)定性高達(dá)99.4 ，但在pCB102復(fù)制子體系下穩(wěn)定性只有76.5（Table 4）。該文獻(xiàn)的報(bào)道，有利于后續(xù)梭菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中確定篩選抗性和相應(yīng)的復(fù)制子（圖片數(shù)據(jù)來(lái)源于文獻(xiàn)）^[4]。2011年，Yu等人在Heap的研究基礎(chǔ)上，將四種只存在復(fù)制子差異的質(zhì)粒從大腸桿菌中通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)到酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率從110^-7-3.310^-6，呈現(xiàn)顯著性差異，pBP1復(fù)制子在酪丁酸梭菌中的轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定性均是更好^[5]。因此，選擇合適的復(fù)制子在梭菌的遺傳轉(zhuǎn)化研究上具有重要意義。

綜上所述：在梭菌的遺傳轉(zhuǎn)化上，提高對(duì)不同梭菌所需復(fù)制子和篩選抗性的關(guān)注，確定合適的復(fù)制子和篩選抗性，有利于獲得高轉(zhuǎn)化效率和高穩(wěn)定性的轉(zhuǎn)化子，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。本公司目前已成功改造可以在大腸桿菌和梭菌中同時(shí)具有復(fù)制功能，帶有pCD6或pBP1復(fù)制子的質(zhì)粒，達(dá)到利用結(jié)合轉(zhuǎn)移方式進(jìn)行梭菌改造的基礎(chǔ)條件。同時(shí)我們擁有成熟的質(zhì)粒改造體系，可以針對(duì)不同梭菌進(jìn)行特異的抗性基因選擇，達(dá)到高效改造梭菌的目的。

銳志魔方生物具有多年的梭菌培養(yǎng)及基因改造經(jīng)驗(yàn)，目前保存及培養(yǎng)以下菌株：

（1）     ATCC 29065 Clostridium leptum. 柔嫩梭菌

（2）     ATCC BAA-442 Clostridium sp

（3）     ATCC TSD-25 Clostridium sp:Strain:KNHIs219

（4）     ATCC TSD-34 Clostridium sp:Strain:ASB410

（5）     DSM 10702 Clostridium butyricum 丁酸梭菌

銳志魔方生物可為用戶提供以下實(shí)驗(yàn)定制服務(wù)：         

（1）     承接各類(lèi)梭菌分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)；                  

（2）     承接梭菌過(guò)表達(dá)株構(gòu)建服務(wù)；                    

（3）     承接梭菌敲除株構(gòu)建服務(wù)；                      

（4）     承接梭菌轉(zhuǎn)座子突變體文庫(kù)構(gòu)建、篩選。             

參考文獻(xiàn)：

[1]Charubin K, Bennett RK, Fast AG, Papoutsakis ET. Engineering Clostridium organisms as microbial cell-factories: challenges & opportunities[J]. Metab Eng. 2018;50:173-191. 

[2]Minton NP, Ehsaan M, Humphreys CM, Little GT, Baker J, Henstra AM, Liew F, Kelly ML, Sheng L, Schwarz K, Zhang Y. A roadmap for gene system development in Clostridium[J]. Anaerobe. 2016;41:104-112. 

[3]Nogle R, Nagaraju S, Utturkar SM, Giannone RJ, Reynoso V, Leang C, Hettich RL, Mitchell WP, Simpson SD, Jewett MC, K?pke M, Brown SD. Clostridium autoethanogenum isopropanol production via native plasmid pCA replicon[J]. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:932363. 

 [4]Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids[J]. J Microbiol Methods. 2009;78(1):79-85. 

[5]Yu M, Du Y, Jiang W, Chang WL, Yang ST, Tang IC. Effects of different replicons in conjugative plasmids on transformation efficiency, plasmid stability, gene expression and n-butanol biosynthesis in Clostridium tyrobutyricum[J]. Appl Microbiol Biotechnol. 2012 ;93(2):881-9.