免疫組化操作規(guī)程

一、實(shí)驗(yàn)器材

微波爐、吹風(fēng)機(jī)、組化筆、濕盒、烤箱、振蕩器、染缸、光學(xué)顯微鏡、純木漿衛(wèi)生紙、計(jì)時(shí)器和通風(fēng)櫥等。

二、實(shí)驗(yàn)原理與意義

免疫組織化學(xué)又稱(chēng)免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見(jiàn)性巧妙地結(jié)合起來(lái)，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡）的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等）。

三、試劑配制

0.01 M PBS（pH 7.34 ）：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加雙蒸水至1000 ml；1000 ml 0.2M PB （pH 7.4）＝5.93 g NaH2PO4·2H2O＋58.02 g Na2HPO4·12H2O in 1000 ml雙蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH2PO4·2H2O：15.6 g in 500 ml ddH2O；B. 0.2 M Na2HPO4·12H2O：71.632 g in 1000 ml dH2O）。

Citrate Buffered Saline（0.01 M檸檬酸緩沖液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH2O（A.Citrate acid（檸檬酸）：10.5 g 加雙蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（檸檬酸鈉）：29.41 g加雙蒸水至1000 ml）。

細(xì)胞通透液：由終濃度分別為0.3%雙氧水和0.3%Triton X-100混合而成。配制方法是先用微波加熱的36 ml PBS，再接著加120 ul TritonX-100，并加熱一會(huì)兒，冷卻至臨用前加0.4 ml 30％H2O2。

5％羊血清或封閉血清，用PBS稀釋。

含0.03％H2O2的0.05％DAB（避光）：用20×DAB（1％，10 mg/ml）5 ul＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。

一抗、二抗均用PBS稀釋。

Xylene、梯度Ethanol（100％×2、95％、80％、70％、50％）、雙蒸水、中性樹(shù)膠（封裱劑）。

蘇木精染液：

四、操作步驟

1、脫蠟、水化

60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes；

100% absolute ethanol：2 ×5 minutes；

95% ethanol 2 minutes；

80% ethanol 2 minutes；

70% ethanol 2 minutes；

distilled water:5 min；

PBS洗3次×3 min。

2、細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶

用封閉通透液浸潤(rùn)切片30 min（RT避光）。配法是用預(yù)熱40 ml PBS加120ul TritonX-100加熱幾分鐘后，臨用前加400 ul 30％H2O2。

PBS溶液洗3次×3 min。

3、抗原修復(fù)暴露抗原決定族

切片放入0.01 M檸檬酸鈉緩沖溶液（pH6.0）后，在微波爐里高火4 min至沸騰后，再加熱約6 min×4次，每次間隔補(bǔ)足液體，防止干片。

4、封閉非特異性蛋白

PBS溶液洗3次×3 min；

將切片取出,周?chē)钟脼V紙吸干,用組化筆在組織周?chē)?huà)上圈,在圓圈內(nèi)組織滴入5%羊血清（與二抗來(lái)源一致）后放入濕盒中,室溫30（10～30）min；

5、一抗孵育

甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織周?chē)鷼埩粞澹苯蛹尤胍严♂尩囊豢梗?：250、500、1000）后，放入濕盒中室溫1小時(shí)，然后4度過(guò)夜，從冰箱中取出需37 ℃復(fù)溫45 min。

6、二抗孵育

將一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次；

用濾紙將圓圈周?chē)乃?，加入已稀釋的二抗后放?7 ℃恒溫烤箱中30 min（回收）。

用PBS洗5次×5 min；

7、SP反應(yīng)

加入SP后放入37度烤箱中30 min。

用PBS洗5次×5 min；

8、顯色

加入DAB（快速滴入，觀察染色情況，倒掉染液），顯色時(shí)間控制在約5 min（3～10 min），由鏡下觀察顏色控制時(shí)間。0.05％DAB（避光）（1:20儲(chǔ)備液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB儲(chǔ)備液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保存。

9、復(fù)染、脫水、透明、封片

用PBS 3次×3min后，用雙蒸水洗5 min；

加一大滴蘇木素染液，胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜蛋白染20 s后自來(lái)水沖洗，雙蒸水洗5 min，再用PBS返藍(lán)5 min。

脫水：50% ethanol 1-2 min，

70% ethanol 1-2 min

95% ethanol 1-2 min；

95% ethanol 1-2 min；

100% absolute ethanol: （1-2） min；

100% absolute ethanol: （1-2） min。

透明：Xylene 1×（1-2） min→Xylene 2×（1-2） min

封片：中性樹(shù)膠。

五、注意事項(xiàng)

蘇木素復(fù)染時(shí)間需要摸索，尤其陽(yáng)性染色也在細(xì)胞核上。

DAB顯色時(shí)間需要達(dá)到*化，鏡下觀察達(dá)到陽(yáng)性染色明顯但背景不太深。

抗體孵育時(shí)間和抗體濃度需要摸索。尤其一抗孵育在4度過(guò)夜。

切片脫蠟和水化要充分；加反應(yīng)液時(shí)要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液，但又防止干片；用組化筆畫(huà)圈時(shí)盡量畫(huà)大一點(diǎn)，否則墨水排斥液體，引起片周邊干片。

片子著色不均勻的原因如下：

脫蠟不充分。可以60 ℃烤20 min，立即放入新鮮的xylene1；

水化不全。應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇；

抗體沒(méi)混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑；

抗體孵育時(shí)，切片放傾斜；

抗體孵育后PBS沖洗不充分。

制片厚薄不均勻等問(wèn)題。染片盒不平，切片傾斜。

一抗從4 ℃拿出后，為什么有人說(shuō)要37度復(fù)溫，目的是什么？

一方面，防止切片從4 ℃直接放入PBS易脫片；

另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有用,4 ℃和37 ℃度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同,前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？

抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制；

一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；

內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高，需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色

非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果；