磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）試劑盒說明書

微量法

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義

磷脂酶A2（EC3.1.1.4）是磷脂sn-2位脂?；饷福瑥V泛存在于動植物組織、細菌、細胞核分泌物中，參與脂肪消化，精子成熟、細胞信號傳遞、脂質過氧化修復、宿主反應等生理過程，在控制體內磷脂類物質平衡、調節(jié)機體新陳代謝、參與疾病的病理進程等方面發(fā)揮著及其重要的作用。

測定原理

磷脂酶A2作用于2-硫代十六酰乙基磷酸膽堿（HEPC）產生游離巰基，與DTNB反應生成黃色物質，在412nm處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器

天平、超速冷凍離心機、研缽、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板。

試劑組成和配制

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 20mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體×5 瓶，-20℃避光保存。臨用前根據用量每瓶加入 1.8mL 試劑二充分混勻。(3天使用完)

樣品處理

1. 組織：按照質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

2. 細胞：按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后于4℃，10000g 離心5min，取全部上清于4℃、100000g 離心 30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

3. 血清：直接測定。

測定操作

計算公式

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

= 73.53×△A÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/g）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

= 73.53×△A÷W

3. 細胞數量計算

酶活性定義：每10⁴個細胞每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力

單位。

PLA2 活性（nmol/min/10⁴cell）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×細胞數量÷V 樣總）÷T= 73.53×△A÷細胞數量

4 按照液體體積計算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/mL）= △A÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T= 73.53×△A

ε：TNB 消光系數，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應總體積，1mL；V 樣：反應體系中加入樣本體積，0.1mL；W：樣本質量，g；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，10min

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

=147.06×△A÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/g）= （ε×d）×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

= 147.06×△A÷W

3. 細胞數量計算

酶活性定義：每10⁴個細胞每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/10⁴cell）= △A÷（ε×d）×V 反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T=147.06×△A÷細胞數量

4 按照液體體積計算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解HEPC產生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/mL）= △A÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T

= 147.06×△A

ε：TNB 消光系數，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V 反總：反應總體積，1mL；V 樣：反應體系中加入樣本體積，0.1mL；W：樣本質量，g；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，10min

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