次使用時(shí)，將試劑盒所帶的全部 RNase A 加入溶液 P1 后（終濃度 100ug/ml）置于 2-8℃保存。如果溶液 P1 中 RNase A 失活，提取的質(zhì)?？赡軙?huì)有微量 RNA 殘留，在溶液 P1 中補(bǔ)加 RNase A 即可。
環(huán)境溫度低時(shí)溶液 P2 中 SDS 可能會(huì)析出渾濁或者沉淀，可在 37℃水浴加熱幾 min，即可恢復(fù)澄清，不要?jiǎng)×覔u晃，以免形成過量的泡沫。

3. 避免試劑長時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH 值變化。

溶液 P3 和去蛋白液 PE 中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
提取質(zhì)粒的量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)?？截悢?shù)等因素有關(guān)。一般高拷貝質(zhì)粒，建議接種單菌落于 1.5-4.5ml 加合適抗生素的 LB 培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng) 14-16 個(gè)小時(shí)，可提取出多達(dá) 20µg 的純凈質(zhì)粒。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?10kb 的大質(zhì)粒，應(yīng)適當(dāng)加大菌體使用量，使用 5-10ml 過夜培養(yǎng)物，同時(shí)按比例增加 P1、P2、P3 的用量，其它步驟相同。
得到的質(zhì)粒 DNA 可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測濃度與純度。OD₂₆₀ 值為 1 相當(dāng)于大約 50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為 2 條或者多條 DNA 條帶，這主要是不同程度的超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒泳動(dòng)位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時(shí)間長短、提取時(shí)操作劇烈程度等有關(guān)。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超過 90%。
洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫， 但應(yīng)該確保 pH 大于 7.5，pH 過低影響洗脫效率。用水洗脫質(zhì)粒應(yīng)該保存在－20℃。質(zhì)粒DNA 如果需要長期保存，可以用 TE 緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA， pH 8.0），但是 EDTA 可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。

自備試劑：無水乙醇操作步驟：

提示：

ð 次使用前請先在漂洗液 WB 和去蛋白液 PE 瓶中加入量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!

ð 將 RNase A 全部加入溶液 P1 中，混勻，每次使用后置于 2-8℃保存。

ð 將溶液 P3 放在冰上預(yù)冷，可以提高產(chǎn)量。

1. 向吸附柱AC 中（吸附柱放入收集管中）加 500μl 的平衡液BL，12,000rpm 離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

2. 取 1.5-4.5ml 過夜培養(yǎng)的菌液，12,000rpm 離心 30 sec，盡可能的倒干上清，收集菌體。收集超過 1.5 ml 菌液，可以離心棄上清后，在同一個(gè) 1.5ml 管內(nèi)加入更多的菌液，重復(fù)步驟 1，直到收集到足夠的菌體。

3. 用 250μl 溶液 P1 重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至*懸浮。

4. 加 250μl 的溶液 P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 4 -7 次使菌體充分裂解。

5. 加 350μl 溶液 P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 4 -7 次，充分混勻時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，

13,000rpm 離心 10 min，小心取上清。加入溶液 P3 后應(yīng)該立即混勻，以免產(chǎn)生 SDS

的局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清

6. 將上一步所得上清加入吸附柱 AC 中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm 離心 30-60

sec，倒掉收集管中的廢液可選步驟:加入 500μl 去蛋白液 PE，12,000rpm 離心 30-60

sec，棄廢液。此步驟為了去除痕量核酸酶等雜質(zhì)，如所用菌株為 JM 系列、HB101 等 endA 菌株或野生型菌株，核酸酶含量豐富，應(yīng)加此步驟；如所用菌株為 XL-1 Blue 和 DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，則可略過此步驟。

7. 加入 500μl 漂洗液 WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心 30 sec，棄掉廢液。

8. 重復(fù)步驟 7。

9. 將吸附柱 AC 放回空收集管中，12,000rpm 離心 2 min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。 10.取出吸附柱 AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，室溫放置幾分鐘。

11.在吸附膜的中間部位加 50μl-100μl 洗脫緩沖液 EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置 2 min，12,000rpm 離心 1 min。如果需要較多量質(zhì)粒，

可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心 1 min。洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要質(zhì)粒濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積，但是小體積不應(yīng)少于 50μl， 體積過小降低質(zhì)粒洗脫效率，減少質(zhì)粒產(chǎn)量。若用ddH₂O 做洗脫液，應(yīng)保證其 pH 值在 7.0-8.5 范圍內(nèi)，pH 值低于 7.0 會(huì)降低洗脫效率。