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2012-5-18 閱讀(1915)
lin-4，第1個(gè)已知的miRNA，在1993年被發(fā)覺(jué)。自此，miRNA的研討就一發(fā)無(wú)法收拾。線蟲(chóng)、蜾蠅等標(biāo)準(zhǔn)樣式有生命的物質(zhì)的研討鑒定出miRNA的很多重邀功能，涵蓋發(fā)育時(shí)期細(xì)胞增生和失去生命的協(xié)調(diào)，抗逆性，脂肪代謝等等。相對(duì)于這些個(gè)劣等的標(biāo)準(zhǔn)樣式有生命的物質(zhì)，哺乳動(dòng)物的miRNA功能研討可就復(fù)雜得多。
在著手的幾年，科學(xué)家們的首重要的條目標(biāo)是利用克隆、有生命的物質(zhì)信息學(xué)和基因表現(xiàn)等辦法編綴出完整的miRNA目次和它的表現(xiàn)形式。隨著這個(gè)目的一天比一天靠近，研討重心又轉(zhuǎn)移至miRNA功能的解釋。針對(duì)這一目的，涌現(xiàn)出多種技術(shù)，有報(bào)告陳述基因剖析、原位雜交、過(guò)表現(xiàn)和沉默、有生命的物質(zhì)信息學(xué)預(yù)先推測(cè)算法等，他們都有助于miRNA功能的推斷。
剖析miRNA的表現(xiàn)
在鑒定新的miRNA時(shí)，一般認(rèn)為合適而使用三種辦法：正向遺傳基因?qū)W、定向克隆和有生命的物質(zhì)信息學(xué)剖析。正向遺傳基因?qū)W主要使用于蜾蠅和線蟲(chóng)中，它經(jīng)過(guò)一個(gè)突變表型來(lái)理解miRNA的功能。第1個(gè)miRNA基因lin-4就是這樣鑒定出的。不過(guò)，正向遺傳基因?qū)W這樣積年來(lái)也就鑒定出非常少幾個(gè)miRNA。這是由于miRNA細(xì)小，只要突變不影響胚珠序列，他們就有潛在力量耐受，因?yàn)檫@個(gè)很難擊中。額外，因?yàn)槿哂啵硇陀煤Y子選不可以辨別眾多miRNA突變體。因?yàn)檫@個(gè)正向遺傳基因?qū)W沒(méi)可能變成鑒定miRNA的主力軍。
在這以后，定向克隆技術(shù)的顯露出來(lái)，讓多種細(xì)胞系和團(tuán)體中的miRNA大規(guī)模鑒定得以成功實(shí)現(xiàn)，涵蓋人、小鼠和斑馬魚(yú)等。miRNA的克隆流程大概如下所述：在改變性別的聚丙烯酰胺凝膠上離合RNA樣品，并回收體積在18-25 nt的斷片。繼續(xù)，給RNA加上5’和3’接頭，并施行RT-PCR，而后將斷片克隆到載體上，構(gòu)建出cDNA文庫(kù)。對(duì)單個(gè)克隆施行測(cè)序和剖析，以確認(rèn)小RNA。到現(xiàn)在為止測(cè)序技術(shù)的興盛也大大增進(jìn)了這種辦法。不過(guò)對(duì)于某些只在特別細(xì)胞類型中表現(xiàn)，或以低水準(zhǔn)表現(xiàn)的miRNA來(lái)說(shuō)，鑒定起來(lái)仍然有困難程度的。額外，介于物理性質(zhì)或轉(zhuǎn)錄后修飾，某些miRNA有可能難于克隆，這也是一個(gè)棘手的問(wèn)題。
同時(shí)，科學(xué)家們也研發(fā)出多種算法，來(lái)預(yù)先推測(cè)miRNA。所得法法都利用了二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的存在是miRNA的主要特點(diǎn)標(biāo)志。那里面很多辦法還有賴序列的守舊性來(lái)區(qū)別miRNA候選物和無(wú)關(guān)的基因組發(fā)夾。另一點(diǎn)辦法則評(píng)估發(fā)夾結(jié)構(gòu)的熱力科學(xué)牢穩(wěn)性，與已知miRNA的序列和結(jié)構(gòu)相仿度。另一種的辦法是考求已知miRNA四周圍的基因組序列，由于很多miRNA都是成簇排布。上下團(tuán)結(jié)小鼠的很多miRNA就是經(jīng)過(guò)這種形式鑒定出的。當(dāng)然，計(jì)算機(jī)預(yù)先推測(cè)出來(lái)的候選miRNA還需求實(shí)驗(yàn)的證驗(yàn)。
