大鼠抑制素A（INHA）ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)
本試劑僅供研究使用       目的：本試劑盒用于測(cè)定大鼠血清，血漿及相關(guān)液體樣本中抑制素A（INHA）的含量。
抑制素A實(shí)驗(yàn)原理：
  本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠抑制素A（INHA）水平。用純化的大鼠抑制素A（INHA）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入抑制素A（INHA），再與HRP標(biāo)記的抑制素A（INHA）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的抑制素A（INHA）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中大鼠抑制素A（INHA）濃度。
抑制素A試劑盒組成：
 
試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存   
說(shuō)明書(shū) 1份 1份    
封板膜 2片（48） 2片（96）    
密封袋 1個(gè) 1個(gè)    
酶標(biāo)包被板 1×48 1×96 2-8℃保存   
標(biāo)準(zhǔn)品：225ng/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存   
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存   
酶標(biāo)試劑 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存   
樣品稀釋液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存   
顯色劑A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存   
顯色劑B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存   
終止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存   
濃縮洗滌液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存

樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1. 標(biāo)2. 準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)3. 包被板上設(shè)標(biāo)4. 準(zhǔn)品孔10孔，5. 在*、第二孔中分別加標(biāo)6. 準(zhǔn)品100μl，7. 然后在*、第二孔中加標(biāo)8. 準(zhǔn)品稀釋液50μl，9. 混勻；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，10. 再在第三、第四孔分別加標(biāo)11. 準(zhǔn)品稀釋液50μl，12. 混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，13. 再各取50μl分別加到第五、第六孔中，14. 再在第五、第六孔中分別加標(biāo)15. 準(zhǔn)品稀釋液50ul，16. 混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，17. 再在第七、第八孔中分別加標(biāo)18. 準(zhǔn)品稀釋液50μl，19. 混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，20. 再在第九第十孔分別加標(biāo)21. 準(zhǔn)品稀釋液50μl，22. 混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，23. 濃度分別為150ng/L，24. 100ng/L ，25. 50ng/L，26. 25ng/L，27.  12.5ng/L）。
28. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不29. 加樣品及酶標(biāo)30. 試劑，31. 其余各步操作相同32. ）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)33. 包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液50μl，34. 然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍35. ）。加樣將樣品加于酶標(biāo)36. 板孔底部，37. 盡量不38. 觸及孔壁，39. 輕輕晃動(dòng)混勻。
40. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
41. 配液：將30（48T的20倍42. ）倍43. 濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍44. ）倍45. 稀釋后備46. 用。
47. 洗滌：小心揭掉封板膜，48. 棄去液體，49. 甩干，50. 每孔加滿(mǎn)洗滌液，51. 靜置30秒后棄去，52. 如此重復(fù)53. 5次，54. 拍干。
55. 加酶：每孔加入酶標(biāo)56. 試劑50μl，57. 空白孔除外。
58. 溫育：操作同59. 3。
60. 洗滌：操作同61. 5。
62. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，63. 再加入顯色劑B50μl，64. 輕輕震65. 蕩混勻，66. 37℃避光顯色15分鐘.
67. 終止：每孔加終止液50μl，68. 終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
69. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，70. 450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。
注意事項(xiàng)：
1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，2． 酶標(biāo)3． 包被板開(kāi)封后如未用完，4． 板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
5． 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，6． 稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，7． 洗滌時(shí)不8． 影響結(jié)果。
9． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，10． 并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，11． 以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，12． 如標(biāo)13． 本數(shù)量多，14． 推薦使用排槍加樣。
15． 請(qǐng)每次測(cè)定的同16． 時(shí)做標(biāo)17． 準(zhǔn)曲線(xiàn)，18． 做復(fù)19． 孔。如標(biāo)20． 本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)21． 準(zhǔn)品孔*孔的OD值），22． 請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍23． 數(shù)（n倍24． ）后再測(cè)定，25． 計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍26． 數(shù)（×n×5）。
27． 封板膜只限一次性使用，28． 以避免交叉污染。
29． 底物請(qǐng)避光保存。
30． 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，31． 試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)32． 儀讀數(shù)為準(zhǔn).
33． 所有樣品，34． 洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
35． 本試劑不同36． 批號(hào)組分不37． 得混用。
計(jì)算：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，   
在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品的OD     
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋     
倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)     
準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式，將樣品的OD值     
代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋     
倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
試劑盒性能：
1.樣品線(xiàn)性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990以上。
2.批內(nèi)與批見(jiàn)應(yīng)分別小于9%和11%
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個(gè)月
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