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實時熒光定量PCR技術(shù)實驗準備與步驟
閱讀：82 發(fā)布時間：2024-7-22 實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。PCR實驗是分子生物學(xué)中常見用的實驗之一，在基因擴增、核酸檢測、基因檢測等方面廣泛應(yīng)用。
一、PCR實驗前的準備:
在開始PCR實驗之前，必須準備好DNA模板（基因組DNA或逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA）、特異性引物（自己設(shè)計或用軟件設(shè)計），并選擇合適的商業(yè)酶（選擇符合您實驗?zāi)康牡拿?span style="font-family:Calibri;box-sizing: border-box;">)
2、引物的特異性影響 PCR 成功的概率，良好的引物設(shè)計對 PCR 擴增的成功至關(guān)重要。當您開始設(shè)計引物時，應(yīng)仔細考慮以下幾個原則：
①引物的長度。PCR引物一般在18-22bp左右。這對于引物特異性和在退火溫度下的結(jié)合來說是足夠長的。
②熔化溫度(Tm)。Tm 定義為在此溫度下，DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA。52-58C 范圍內(nèi)的引物 Tm 是最佳的。
③GC 含量。最佳 GC 含量應(yīng)為 40-60%。
④許多軟件可用于引物設(shè)計，例如primer5和Oligo。這些軟件推薦的引物通?？梢詽M足我們的需求。
二、PCR實驗步驟方法如下：
根據(jù)PCR使用說明進行試劑混合預(yù)配，并設(shè)置 PCR 循環(huán)。簡而言之，PCR需要經(jīng)過以下循環(huán)：
1、初始化步驟
這僅對熱啟動 PCR 必須的。此步驟將溶液加熱至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。該步驟的時間取決于所使用的聚合酶。
2、變性步驟
DNA是雙鏈分子，DNA擴增需要引物與單鏈DNA模板相互作用。在此步驟中，將反應(yīng)混合物加熱至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破壞兩條鏈之間的氫鍵并生成單鏈 DNA 分子。此時進入 PCR 循環(huán)。
3、退火步驟
變性后，反應(yīng)混合物中的 DNA 模板是單鏈的。由于引物與DNA模板互補，當反應(yīng)溫度降低到50-65℃時，引物會與模板序列匹配，互補堿基之間形成氫鍵。退火溫度取決于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。該步驟將持續(xù)約 20-40 秒以全退火，然后聚合酶將定位到引物-模板雜交體以開始 DNA 組裝。
4、伸長步驟
在此步驟中，DNA 聚合酶開始合成 DNA，因此溫度應(yīng)為 DNA 聚合酶的最適溫度。一般選擇 72°C，但有些酶在 68°C 時效果更好。這一步與體內(nèi)DNA復(fù)制非常相似，DNA聚合酶將dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向與模板互補，最終產(chǎn)生新的雙鏈DNA片段。延伸時間取決于目標 DNA 片段的長度和 DNA 聚合酶的能力。一般來說，DNA 聚合酶每 60 秒產(chǎn)生一千個堿基。
5、2~4步稱為一個循環(huán)，每循環(huán)一次，目標片段量翻倍。一個 PCR 過程使用 30-35 個循環(huán)。在 PCR 循環(huán)的早期，PCR 產(chǎn)物以指數(shù)速率積累，而在 PCR 循環(huán)的后期，隨著 dNTPs、引物的減少和 DNA 聚合酶在變性溫度下的失活，反應(yīng)減慢，PCR 速率逐漸下降。
6、最終伸長率。
30-35個循環(huán)結(jié)束后，在68-74℃的溫度下最終延伸約5-10分鐘，以充分延伸剩余的單鏈DNA。
7、貯存。
最終產(chǎn)品可以在 PCR 機器中維持溫度在 4-10℃。