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轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆基因的改進(jìn)
閱讀：245 發(fā)布時(shí)間：2016-5-6 ELISA試劑盒基因標(biāo)簽法克隆植物組織中的基因是較為常用的一種方法，T-DNA和轉(zhuǎn)座子均可作為基因標(biāo)簽。
轉(zhuǎn)座子zui早由美國(guó)的細(xì)胞遺傳學(xué)家Mc-clintock在玉米中發(fā)現(xiàn)，它是指基因組中一段特定DN段，能在轉(zhuǎn)位酶的作用下從基因組的一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)。轉(zhuǎn)座子不僅能在本基因組中轉(zhuǎn)座，也能轉(zhuǎn)入其它植物的基因組中。轉(zhuǎn)座的結(jié)果是使被轉(zhuǎn)入的基因失活，從而有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生表型突變株。然后構(gòu)建一個(gè)對(duì)應(yīng)于突變株的基因庫(kù)，用作標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座子作為探針從基因庫(kù)中篩選相對(duì)應(yīng)的克隆，分離得到相對(duì)應(yīng)于變異的基因，這就是轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽克隆基因。
玉米的Ac/Ds轉(zhuǎn)座子家族是研究較為深入的植物轉(zhuǎn)座子。
2 Ac、Ds轉(zhuǎn)座子作基因標(biāo)簽時(shí)遇到的問(wèn)題
2．1 Ac屬于自主性轉(zhuǎn)座子，自己能編碼轉(zhuǎn)位酶，因此可直接用于基因標(biāo)簽。但是由于Ac能自由地在基因組中轉(zhuǎn)座，結(jié)果使轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的變異不穩(wěn)定，給確定和分析突變基因帶來(lái)困難。
2．2 Ds屬非自主性轉(zhuǎn)座子，本身不能編碼轉(zhuǎn)位酶，必須依靠Ac轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)位酶才能產(chǎn)生轉(zhuǎn)座，因此Ds只有和Ac聯(lián)合使用才能做為基因標(biāo)簽。
2．3 Ac和Ds聯(lián)合使用后遇到的問(wèn)題是Ac本身的轉(zhuǎn)座成為除Ds之外又一個(gè)轉(zhuǎn)座因素，因此產(chǎn)生突變后，要首先經(jīng)過(guò)遺傳分析確定突變因子是哪一個(gè)轉(zhuǎn)座子，才能用探針進(jìn)行篩選克隆，這就增加了分離基因的難度和工作量。另外，Ac和Ds同時(shí)存在情況下，Ds能在Ac產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶作用下頻繁轉(zhuǎn)位，難以產(chǎn)生穩(wěn)定的突變，這又產(chǎn)生了與Ac單獨(dú)使用時(shí)存在的問(wèn)題。
2．4 由以上分析，轉(zhuǎn)座子Ac和Ds聯(lián)合使用時(shí)必須從兩方面進(jìn)行改進(jìn)：首先，如何使Ac穩(wěn)定下來(lái)，即只有產(chǎn)生轉(zhuǎn)位酶的能力而無(wú)轉(zhuǎn)座的能力，從而減少產(chǎn)生突變的轉(zhuǎn)座子種類。此外，如何使Ds轉(zhuǎn)座后，將產(chǎn)生轉(zhuǎn)座酶的Ac分離，從而使Ds穩(wěn)定下來(lái)，不再轉(zhuǎn)座，使產(chǎn)生的變異得到穩(wěn)定。人們對(duì)Ac、Ds進(jìn)行改進(jìn)后，發(fā)展了一種稱為sAc/Ds的雙系統(tǒng)法。
3 sAc/Ds雙系統(tǒng)法
3．1 對(duì)Ac的改進(jìn) Ac是一段長(zhǎng)約為4.5kb的DN段，人為將其末端轉(zhuǎn)位必須的一段DNA序列切除后，它就不能再借助于轉(zhuǎn)位酶進(jìn)行轉(zhuǎn)位，但仍能正常編碼轉(zhuǎn)位酶，這種修飾后的Ac稱為穩(wěn)定的Ac(StableAc，sAc)。sAc產(chǎn)生的轉(zhuǎn)位酶量可由放在轉(zhuǎn)位酶基因之前的啟動(dòng)子控制，從而控制Ds在基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)位頻率。如果用Ac本身的啟動(dòng)子，其作用較弱，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)位酶少，Ds轉(zhuǎn)座的頻率較低，轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的突變就比較穩(wěn)定。如果用強(qiáng)啟動(dòng)子，則轉(zhuǎn)位酶活力高，Ds轉(zhuǎn)位頻繁，產(chǎn)生的變異頻率較高。同時(shí)為了篩選sAc的轉(zhuǎn)化株還需要在Ac上克隆一個(gè)標(biāo)記基因。用于sAc/Ds雙系統(tǒng)法中sAc的構(gòu)建方法略。
3．2 對(duì)Ds的改進(jìn) 對(duì)Ds改進(jìn)的目的有兩個(gè)：第1，能方便地檢測(cè)Ds是否已經(jīng)從原位置轉(zhuǎn)座；第2，能檢測(cè)到Ds是否已轉(zhuǎn)移到基因組的另一個(gè)位置。改進(jìn)的方法是首先將Ds克隆到一個(gè)標(biāo)記基因的啟動(dòng)子和密碼子之間，這樣可以通過(guò)篩選對(duì)抗生素的抗性來(lái)檢測(cè)Ds是否已經(jīng)轉(zhuǎn)座。另外在不影響Ds轉(zhuǎn)座能力的前提下，在Ds的DNA序列中間克隆上另一個(gè)標(biāo)記基因，這個(gè)基因?qū)⑴cDs一起轉(zhuǎn)座，這樣就可以篩選對(duì)這一基因的抗性來(lái)檢測(cè)Ds是否已經(jīng)轉(zhuǎn)座和轉(zhuǎn)座的位置。
3．3 sAc/Ds雙系統(tǒng)法克隆基因的原因及步驟
1)將sAc和Ds分別與T-DNA連接，在農(nóng)桿菌的幫助下分別轉(zhuǎn)入植物中，獲得sAc的轉(zhuǎn)化植株和Ds的轉(zhuǎn)化植株。 2)將sAc轉(zhuǎn)化株與Ds轉(zhuǎn)化株雜交，挑選同時(shí)含有sAc和Ds的子一代植株。
3)雜合植株中，Ds在sAc產(chǎn)生的轉(zhuǎn)位酶幫助下轉(zhuǎn)座，引起某個(gè)基因突變，從而產(chǎn)生表型突變株。
4)通過(guò)突變植株的自交和回交，選擇僅含有Ds而無(wú)sAc的植株，從而使變異得到穩(wěn)定。建立對(duì)應(yīng)于變異株的基因文庫(kù)或cDNA文庫(kù)。
5)用IPCR的方法擴(kuò)增與Ds相鄰的DN段，利用此片段作探針直接從基因文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中篩選對(duì)應(yīng)的基因克隆，通過(guò)DNA測(cè)序和比較了解該基因的特征。
6)穩(wěn)定的變異株再與sAc轉(zhuǎn)化株雜交，使得Ds再次轉(zhuǎn)位，使突變的基因得到恢復(fù)，從而得到回復(fù)突變株，用于檢驗(yàn)所得到的基因是否對(duì)應(yīng)于變異的基因。
4 sAc/Ds雙系統(tǒng)法的應(yīng)用
用sAc/Ds雙系統(tǒng)法克隆基因，容易得到回復(fù)突變株和容易產(chǎn)生再次突變克隆其它基因，與T-DNA做基因標(biāo)簽相比省去了再次轉(zhuǎn)化的繁瑣程序，為克隆基因的工作帶來(lái)了極大方便。
理論上用sAc/Ds雙系統(tǒng)法克隆基因如果有足夠的轉(zhuǎn)化株，能克隆到任何一個(gè)基因，另外這種方法還可用于定點(diǎn)突變。如果對(duì)某一基因我們不知道它的表達(dá)產(chǎn)物，也不知道它何時(shí)在何部位表達(dá)，sAc/Ds雙系統(tǒng)法是一種較好的克隆基因的方法，該方法以其*的優(yōu)點(diǎn)在克隆基因工作中將得到更廣泛的應(yīng)用。