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嘌呤霉素篩選細胞的原理
閱讀:5783 發(fā)布時間:2016-5-9ELISA試劑盒嘌呤霉素(puromycin;PM ) 是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑,它具有與tRNA分子末端類似的結(jié)構(gòu),能夠同氨基酸結(jié)合,代替氨?;膖RNA同核糖體的A位點結(jié)合,并摻入到生長的肽鏈中。用嘌呤霉素篩選細胞方法如下:
嘌呤霉素篩選細胞
轉(zhuǎn)染(24孔板進行)或電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)24小時,按10%密度傳代(傳至36mm平皿),繼續(xù)培養(yǎng)24小時,待細胞密度增至20%-25%回合時;
去掉培養(yǎng)液,PBS洗一次,加入按照*嘌呤霉素篩選細胞的濃度(殺傷曲線試驗確定)配制好的嘌呤霉素篩選細胞培養(yǎng)基2-3ml。
根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞的存活情況,每隔2天更換一次嘌呤霉素篩選細胞用培養(yǎng)基(培養(yǎng)基用量為2-4ml,細胞多,多家培養(yǎng)基,細胞少,少加培養(yǎng)基),一般在3-1天內(nèi)出現(xiàn)細胞大量或少量死亡情況(如果轉(zhuǎn)染效率或電轉(zhuǎn)效率高,則死亡少;如果轉(zhuǎn)染率或電轉(zhuǎn)率低,則死亡多;如果篩選濃度偏低,嘌呤霉素篩選細胞培養(yǎng)基用量少,細胞密度大于80%,會導致大量假陽性克?。H绻龠x*周,出現(xiàn)細胞大量死亡,則在原培養(yǎng)皿中繼續(xù)加入嘌呤霉素篩選細胞培養(yǎng)基篩選一周;如果刪選*周,出現(xiàn)細胞少量死亡,則把細胞按照10%密度傳代(傳至35mm平皿,傳一個皿即可,多余細胞丟棄),利用少選培養(yǎng)基進行篩選一周;
篩選第二周結(jié)束后,則把細胞消化下來。進行重點稀釋(10ul培養(yǎng)基中含1個細胞,用篩選培養(yǎng)基),把上述10ul細胞懸液假日96孔板中(提前加入40ul篩選培養(yǎng)基),伊紅加入24孔,4小時候觀察每個孔的情況。記錄只含一個細胞的孔,含有一個細胞的孔用于繼續(xù)篩選,其余孔舍棄;
根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況換入新的嘌呤霉素篩選細胞用培養(yǎng)基待細胞密度為80%時,將其傳代至24孔板中增殖,待細胞密度為80%時,將其傳代至6孔板中增殖,待細胞密度為80%時,將其傳代至T25瓶(一傳3)中增殖,每隔3天換液。
細胞大量擴增后,一瓶用于提取中RNA進行QPCR檢測,一瓶用于總蛋白進行WB檢測,另一瓶用于保種,根據(jù)QPCR和WB結(jié)果取舍陽性克隆。
嘌呤霉素篩選細胞方法如上,具體的嘌呤霉素篩選細胞讓發(fā)如上,嘌呤霉素穩(wěn)定性高,可以常溫運輸,收到產(chǎn)品后4℃存放;
嘌呤霉素在室溫條件下可存放3個月,4℃條件下保質(zhì)期一年。為了達到的穩(wěn)定狀態(tài)和zui長的保質(zhì)期,存放于-20°C,保質(zhì)期為2年。
BAMBI 腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白BAMBI抗體
BCL9 B淋巴細胞淋巴瘤因子9抗體
Biliverdin Reductase 膽綠素還原酶抗體
BIVM BIVM蛋白抗體
Blood Group Lewis a 血型Lewis A抗原抗體
Blood Group Lewis b 粘蛋白/巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3抗體
BLM Bloom綜合征相關(guān)蛋白抗體
BMP8b 骨形態(tài)發(fā)生蛋白8b抗體
phospho-BMX (Tyr566) 磷酸化非受體性蛋白酪氨酸激酶ETK抗體
phospho-BNIP3 (Ser95) 磷酸化促凋亡調(diào)節(jié)蛋白BNIP3抗體
BOB1 B淋巴細胞特異性激活OCT結(jié)合蛋白1抗體