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白細(xì)胞調(diào)節(jié)素(LR)ELISA試劑盒說(shuō)明

閱讀:79          發(fā)布時(shí)間:2015-8-31
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         白細(xì)胞調(diào)節(jié)素(LR)ELISA試劑盒說(shuō)明書                           

         該試劑盒以 HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物(HRP Streptavidin Conjugate,

HRP-SA)為基礎(chǔ),可用于檢測(cè)血液,細(xì)胞、組織內(nèi)的特異性 VEGF 抗原。該試劑

盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、定性定位準(zhǔn)確、背景清晰。在所用的 VEGF 一抗與

相應(yīng)靶抗原結(jié)合后,用生物化二抗與一抗特異性結(jié)合,zui后加入 HRP-SA,形成

抗原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA 復(fù)合物,顯微鏡下觀察成像。 

        試劑盒所含試劑: 

試劑 A 通透液:0.1% Triton-X 100   10 mL(選用) 

試劑 B 封閉緩沖液(封閉用)20 mL 

試劑 C (*分裝)已稀釋的即用型 VEGF 一抗(2.5ml) 

試劑 D (*分裝)生物素化羊抗兔 IgG 1 支 

(濃度 1.5 mg/mL,稀釋比為 1:300~1:500)1000 μL+抗體稀釋液 20ml 

試劑 E HRP-SA 復(fù)合物 1 支(濃度 1 μM,稀釋比 1:50~1:200)100 μL 

試劑 F DAB 顯色液 5ml 

用戶自備試劑: 

1. 10mM TBS(pH7.2~7.4) 

三羥基氨基甲烷 1.21g 

        加蒸餾水 800mL,濃鹽酸調(diào) pH 值至 7.2~7.4,zui后定容至 1000mL 

TBS-T:TBS+Tween 20(0.05%體積比) 

2.抗原修復(fù)液(依檢測(cè)抗原不同而選擇不同的修復(fù)液) 

10mM pH6.0 檸檬酸緩沖液 

檸檬酸 0.38g 

檸檬酸三鈉 2.45g 

加蒸餾水 900mL,濃鹽酸調(diào) pH 值至 6.0,zui后定容至 1000mL 

或:0.5M EDTA 修復(fù)液(pH8.0) 

EDTA·2H2O 186.1g 

檸檬酸三鈉 2.45g 

加蒸餾水 700mL,用 10mM NaOH 調(diào) pH 值至 8.0,zui后定容至 1000Ml 

3. 緩沖甘油封固劑 10 mL 

4. Tween 20 5 mL 

        石蠟包埋組織切片免疫染色

        實(shí)驗(yàn)步驟(建議方案): 

石蠟包埋組織切片 3~4μm 厚度 

1.烤片: 將待做切片置于切片架上,于 60℃恒溫烤箱中至少烤 1 hr; 

2.脫蠟: 切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟 3 次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每次

10 min; 

3.水化: 切片經(jīng)下行酒精水化,無(wú)水乙醇 5min,95%乙醇 2 次(每次 2min),85%

乙醇 2 min;75%乙醇 2min,自來(lái)水沖洗,ddH2O 洗 2×2min; 

4.抗原修復(fù): 根據(jù)抗體說(shuō)明書推薦方法進(jìn)行抗原修復(fù),常采用高壓、微波(溫

度達(dá)到 98~100℃)或酶消化修復(fù)法,室溫自然冷卻,自來(lái)水沖洗,ddH2O 洗 2×

2min,TBS 洗滌(2×2min)(具體修復(fù)方法見附 1)* 注:有些抗原勿需修復(fù),

直接進(jìn)入第 5 步封閉。 

5.封閉: 滴加試劑 B,37℃濕盒孵育 30 min; 

6.加一抗:滴加用試劑 C(即用型一抗),37℃濕盒孵育 2 hr 或 4

7.洗滌: TBS-T 洗滌(3×5 min); 

8.封閉: 滴加試劑 B,37℃濕盒孵育 10 min; 

9.加二抗: 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗(試劑 D),37℃濕盒中孵育

30 min; 

10.洗滌: TBS-T 洗滌(3×5 min); 

11.封閉: 滴加試劑 Tween 20,37℃濕盒孵育封閉 20 min; 

12.加 HRP-SA: 滴加用試劑 C 稀釋的試劑 E(1:50~200,終濃度 5~20 nM),37

℃濕盒中孵育 30 min; 

13.洗滌: TBS-T 洗滌(3×5 min),TBS 洗滌(2×5 min); 

14.顯色:應(yīng)用 DAB 溶液(試劑 F)顯色; 

15.復(fù)染:自來(lái)水充分沖洗,復(fù)染

16.封片: 待組織標(biāo)本干后,用試劑緩沖甘油封固劑封片; 

17.觀察成像: 顯微鏡下觀察成像。 

注意事項(xiàng): 

1. 修復(fù)后緩沖液須自然冷卻,自來(lái)水沖洗后方能把切片取出,驟冷有可能導(dǎo)致

結(jié)晶或抗原封閉。 

2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到,用過(guò)的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使

用。 

3. 若試劑為微量濃縮液,用前應(yīng)低速離心,將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。 

4. 封片前一定要換用 TBS 充分洗滌,以便洗去組織上殘留的 Tween 20,否則會(huì)

影響結(jié)果觀察。 

5. 如須復(fù)染細(xì)胞核,則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進(jìn)行封

片。 

附 1: 

        抗原修復(fù)方法

常用抗原修復(fù)液:檸檬酸緩沖液(0.01M pH6.0)、EDTA 抗原修復(fù)液(pH8.0 或

9.0)等等。 

一、酶消化修復(fù)法酶消化修復(fù)

切片脫蠟水化處理,TBS 沖洗,在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶,37℃孵育

20~30min 后 TBS 沖洗即可。 

二、微波抗原修復(fù)法

微波盒中加入抗原修復(fù)液微波加熱至沸騰,將脫蠟水化后的切片置于耐高溫塑料

切片架上,放入已沸騰的緩沖液中,中檔或繼續(xù)微波 10~15min,取出微波

盒冷卻至室溫后,自來(lái)水沖洗,取出切片。因不同微波爐微波處理時(shí)間存在差異,

須自行調(diào)整。 

三、直接高壓抗原修復(fù)法

取修復(fù)液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰,將組織切片置于耐高溫切片架上,修復(fù)

液沸騰后放入切片架,蓋上鍋蓋,待噴氣后計(jì)時(shí) 1.5~2.5min 即可脫離熱源,自

然冷卻至室溫后自來(lái)水沖洗,取出切片。此方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的修復(fù)。 

四、隔水式高壓抗原修復(fù)法

不銹鋼高壓鍋中加自來(lái)水加熱至沸騰,微波盒中加入修復(fù)液于微波爐中加熱至沸

騰,將切片放入微波盒中,再將微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋,待噴氣后計(jì)時(shí)

4~8 min 即可關(guān)閉熱源,自然冷卻至室溫后自來(lái)水沖洗,取出切片。此方法適用

于較難檢測(cè)或核抗原的修復(fù)。 


         該試劑盒以 HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物(HRP Streptavidin Conjugate,

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