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小鼠ELISA試劑盒實(shí)驗稀釋血清的步驟

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小鼠ELISA試劑盒實(shí)驗稀釋血清的步驟:
先把蛋白稀釋一定的倍數(shù),比如說10倍、20倍稀釋(這樣可以大體確定一個參數(shù)),將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板,再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌,再加酶結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng),經(jīng)孵育洗滌后,加底物溶液顯色,終止反應(yīng)后分別測定O.D值,選擇O.D值≥1.0的那個抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個O.D值稍大于1.0,而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的O.D值有明顯差別。
操作步驟:
1. 加標(biāo)準(zhǔn)品:在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔,依次加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50ul(建議每個濃度做2個平行孔)
2. 加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品40μl,然后再加樣品親和素10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4. 配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。
6. 加酶:除空白孔外每孔加入酶標(biāo)試劑50μl。
7. 溫育:操作同3。
8. 洗滌:操作同5。
9. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.
10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
11. 測定:以空白空調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
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