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ELISA的試劑的制備
閱讀：112 發(fā)布時間：2016-4-14（一）固相載體ELISA試劑盒
可作ELISA中載體的物質(zhì)很多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。在ELISA測定過程中，它作為載體和容器，不參與化學反應。加之它的價格低廉，所以被普遍采用。
ELISA載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應板。小試管的特點是還能兼作反應的容器，zui后放入分光光度計中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過程中使圓珠滾動淋洗，效果更好。zui常用的載體為微量反應板，于ELISA測定的產(chǎn)品也稱為ELISA板，通用的標準板形是8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測，有制成8聯(lián)或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，并可在特定的比色計上迅速讀出結果。現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量反應板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標準化極為有利。
良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)加入適當稀釋的酶標抗人IgG抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應后分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻獥l件，使各讀數(shù)在0.8左右。計算所有讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應小于10%.
與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特點為質(zhì)軟板薄，可切割，價廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時也略高。
為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可用以下方法加以檢驗：用其它免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和一個典型的陰性標本。將它們分別進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進行測定，然后比較測定結果。在哪一種載體上陽性結果與陰性結果判別zui大，這種載體就是這一ELISA測定的zui合適的固相載體。
除塑料制品外，固相酶免疫測定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類測定形式將在本章第五節(jié)“膜載體的酶免疫測定"中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的，反應時固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應的速率，反應結束后用磁鐵吸引作為分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀器。
（二）抗原和抗體
在ELISA實施過程中，抗原和抗體的質(zhì)量是實驗是否成功的關鍵因素。本法要求所用抗原純度高，抗體效價高、親和力強。
ELISA所用抗原有三個來源：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于動物組織或體液、微生物培養(yǎng)物等，一般含有多種抗原成分，需經(jīng)純化，提取出特定的抗原成分后才可應用，因此也稱提純抗原（purifiedantigen）。重組抗原和多肽抗原均為人工合成品，使用安全，而且純度高，干擾物質(zhì)少。因此雖然制備合成抗原有較高的技術難度且要求較為昂貴的儀器設備和試劑，其應用仍十分普遍，特別是對那些天然抗原不易得到的試驗，更顯出其獨到之處。
用于ELISA的抗體有多克隆的和單克隆的。抗血清成分復雜，應從中提取IgG才可用于包被固相或酶標記。含單克隆抗體的小鼠腹水中的特異性抗體含量較高，有時可適當稀釋后直接進行包被。制備酶結合物用的抗體的質(zhì)量往往要求有較高的純度。經(jīng)硫酸銨鹽析純化的IgG可進一步用各種分子篩層析提純。也可用親和層析法提純特異性IgG，如用酶消化IgG后提取的Fab片段，則效果更好。
（三）免疫吸附劑
固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被（coating）。由于載體的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為載體，通常將抗原或抗體溶于緩沖液（zui常用的為pH9.6的碳酸緩沖液）中，加于ELISA板孔中在4℃，經(jīng)清洗后即可應用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低，固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)*覆蓋，其后加入的血清標本和酶結合物中的蛋白質(zhì)也會部分地吸附于固相載體表面，zui后產(chǎn)生非特異性顯色而導致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過程稱為封閉（blocking）。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時間而不失去其免疫活性醫(yī)`學教育網(wǎng)搜集整理。
（四）酶和底物
ELISA中所用的酶要求純度高、催化反應的轉(zhuǎn)化率高、專一性強、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、價格不貴、制備成的酶標抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。在受檢標本中不存在與標記酶相同的酶。另外它的相應底物應易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定，光吸收高。ELISA中zui常用的酶為辣根過氧化酶（HRP）和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶