人膽囊動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)產(chǎn)品：人頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞棒狀桿菌Corynebacterium glutamicum (Kinoshita et al.) Abe et al大鼠肺巨噬細(xì)胞產(chǎn)氨短桿菌Brevibacteriumammoniagenes(CookeandKeith)Breed人毛囊成纖維細(xì)胞豇豆慢生根瘤菌Bradyrhizobiumsp兔DRG神經(jīng)元細(xì)胞膠質(zhì)芽孢桿菌Bacillusmucila

一、細(xì)胞基本屬性：

 

包被條件： 

培養(yǎng)基：原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系

換液頻率：每2-3天換液一次

傳代比例：

消化液：0.25%胰蛋bai酶

培養(yǎng)條件：氣相：  空氣，95%；CO2 ，5%

原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺(tái)中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開(kāi)顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM

漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過(guò)夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

原代細(xì)胞使用方法：

是一種貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈上皮樣，多角形細(xì)胞，在技術(shù)部標(biāo)準(zhǔn)操作流程下，細(xì)胞可傳2-3代；建議您收到細(xì)胞后盡快進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

客戶(hù)收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 貼壁細(xì)胞消化

1)吸出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2)添加0.25%消化液1mL至T25培養(yǎng)瓶中，輕微轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶底后，吸出多余消化液，37℃溫浴1-3min；倒置顯微鏡下觀(guān)察，待細(xì)胞回縮變圓后，再加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)用吸管輕輕吹打混勻，按傳代比例接種T25培養(yǎng)瓶傳代，然后補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基至5mL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；

4)待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)觀(guān)察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基。

3. 細(xì)胞收貨脫落

1)收集所有細(xì)胞懸液，1000rpm，離心5min，保留沉淀；

2)添加0.25%消化液0.5mL至離心管中，重懸沉淀，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱靜置5-7min)；消化完向離心管內(nèi)加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)經(jīng)1000rpm，離心5min，丟棄上清，用5ml培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；

4)待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)觀(guān)察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基(37℃預(yù)熱)。

5)原瓶?jī)?nèi)貼壁細(xì)胞按正常消化處理。

4. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

因原代細(xì)胞貼壁特殊性，貼壁的原代細(xì)胞在消化后轉(zhuǎn)移至其他實(shí)驗(yàn)器皿（如玻璃爬片、培養(yǎng)板、共聚焦培養(yǎng)皿等）時(shí)，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)器皿進(jìn)行包被，以增強(qiáng)細(xì)胞貼壁性，避免細(xì)胞因沒(méi)貼好影響實(shí)驗(yàn)；包被條件常選用鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2） ，多聚賴(lài)氨酸PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%），依據(jù)細(xì)胞種類(lèi)而定。懸浮/半懸浮細(xì)胞無(wú)需包被。
公司正在出售的產(chǎn)品：
人多形性惡性膠質(zhì)瘤T98G(STR鑒定正確)

兔肝臟間質(zhì)細(xì)胞（永生化）
鴨胚胎成纖維細(xì)胞（永生化）
小鼠腎小球系膜細(xì)胞（永生化）
小鼠脂肪干細(xì)胞（永生化）
豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（永生化
小鼠胚胎成纖維細(xì)胞
小鼠結(jié)腸癌帶熒光素酶
大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞
人宮頸癌細(xì)胞
人膀胱癌細(xì)胞
人骨肉瘤細(xì)胞
急性髓系細(xì)胞白血病細(xì)胞
豬扁桃體上皮細(xì)胞（永生化）
豬（萊蕪）腹部脂肪干細(xì)胞（永生化）
Halomonas hydrothermalis熱液口鹽單胞菌
Halomonas sulfidaeris硫化物礦鹽單胞菌
Algoriphagus halophilus嗜鹽噬冷菌
Algoriphagus mannitolivorans食甘醇噬冷菌
Algoriphagus ornithinivorans食酸噬冷菌
Halomonas ventosae樊氏鹽單胞菌
Pediococcus claussenii克氏片球菌
Halovibrio denitrificans反硝化鹽弧菌
Haloferax sulfurifontis硫泉富鹽菌
Haloarcula aidinensis艾丁鹽盒菌
人膽囊動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Halomonas campisalis鹽田鹽單胞菌
Halomonas desiderata期望鹽單胞菌
Pseudomonas alcaliphila嗜堿假單胞菌
Marinobacter maritimus近海海桿狀菌
Thermus thermophilus嗜熱棲熱菌