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DTT特性與保存及其在蛋白純化和保存中的作用
點擊次數(shù)：5574 發(fā)布時間：2016-8-30
DTT( 二硫蘇糖醇)是實驗室常用的還原試劑，常被用于蛋白質(zhì)保存以及蛋白二硫鍵的還原。DTT的入特點是極易被氧化，穩(wěn)定性較差，一般DTT常保存于-20度中可以長達數(shù)年。
DTT是一種很強的還原劑，其還原性很大程度上是由于其氧化狀態(tài)六元環(huán)(含二硫鍵)的構象穩(wěn)定性。它的氧化還原電勢在pH為7時為-0.33伏。
DTT特點與DDT的保存
DTT是一種常用還原劑，有抗氧化作用，進口分裝。DTT和巰基乙醇相比，作用相似，但DTT的刺激性氣味要小很多，毒性也比巰基乙醇低很多。而且DTT比巰基乙醇的濃度低7倍時，兩者效果相近。但DTT價格略高一些。DTT粉末的一般保存條件：-20℃保存。1M DTT溶液可以在-20℃保存2年以上。
由于容易被空氣氧化，因此DTT的穩(wěn)定性較差;但冷凍保存或在惰性氣體中處理能夠延長它的使用壽命。由于質(zhì)子化的硫的親核性較低，隨著pH值的降低，DTT的有效還原性也隨之降低;而Tris(2-carboxyethyl)phosphine HCl(TCEP鹽酸鹽)可以作為低pH值條件下DTT的替代品，而且也比DTT更為穩(wěn)定。
應用：
DTT的用途之一是作為巰基化DNA的還原劑和去保護劑。巰基化DNA末端硫原子在溶液中趨向于形成二聚體，特別是在存在氧氣的情況下。這種二聚化大大降低了一些偶聯(lián)反應實驗(如DNA在生物感應器中的固定)的效率;而在DNA溶液中加入DTT，反應一段時間后除去，就可以降低DNA的二聚化。
DTT也常常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵。但DTT往往無法還原包埋于蛋白質(zhì)結構內(nèi)部(溶劑不可及)的二硫鍵，這類二硫鍵的還原常常需要先將蛋白質(zhì)變性(高溫加熱或加入變性劑，如6M 鹽酸胍、8M 尿素或1% SDS)。反之，根據(jù)DTT存在情況下，二硫鍵還原速度的不同，可以判斷其包埋程度的深淺。
DTT在蛋白純化和保存中的作用
我們知道Cys存在與許多蛋白中，且其中的-SH常作為活性中心發(fā)揮作用，或者，兩個-SH連接成二硫鍵，是維持蛋白質(zhì)構象重要橋梁。-SH具有很強的還原性，溶液被溶液中的溶解氧或其它氧化物氧化，從使蛋白失去活性。所以，在蛋白純化和保存時，在溶液中加入一定量的DTT，以免蛋白-SH被氧化而失活。但這里就有一個矛盾，DTT該加多少量，以使-SH保持還原狀態(tài)，而使二硫鍵免遭還原?除了上述作用，DTT還有哪些方面可以起到作用?
我也曾聽一高人說起過，以摩爾數(shù)計算，5-10倍的量來保護-SH。如果蛋白報存buffer中含有15%左右的甘油，對蛋白具有很好的穩(wěn)定作用。補充一點：如果dtt和蛋白摩爾比例比例增大到1：100，DTT就能破壞2硫鍵了，這時對應的濃度一般在10mM左右，這個一般在做還原肽圖的時候用到。
不過有些分子內(nèi)的二硫鍵由于空間位阻的作用，還原劑的量增加到很大也不能破壞。這時可能要配合尿素等變性劑才能*打斷二硫鍵(如包涵體變性)
DTT在離子狀態(tài)才有作用，在pH7-9.5的時候作用zui強，pH降到3以下幾無電離，因此可以通過降低pH至3以下來終止DTT作現(xiàn)在才知道DTT作用還受到pH的影響。提到尿素變性，要是蛋白存在分子間或分子內(nèi)二硫鍵，即使具有高濃度的尿素或鹽酸胍，而沒有DTT等還原劑，那是否也不能使蛋白*變性(斷裂二硫鍵)?
我記得有篇“從純化到星辰”文章中提到“萬金油”配方是這樣的:
50mM Tris pH 7.9
0.5mM EDTA
50mM NaCl
5% glycerol
DTT斷裂二硫鍵需要什么的條件?蛋白的二硫鍵斷裂后，形態(tài)、功能等發(fā)生怎樣的改變?
我不是專門搞生化的。只是知道點皮毛而已，就我了解的而言，western blot要得以進行，特別是抗體要和目的蛋白結合，一方面要使打開蛋白質(zhì)的SS鍵，因為如果SS鍵不打開，很有可能抗體不能很好的識別特定的位點，就不能結合上去;另一方面還要用SDS-PAGE消除蛋白質(zhì)分子內(nèi)的各種非共價鍵，使蛋白質(zhì)所帶電荷和其分子量成正比，這樣才能使蛋白質(zhì)分離出來。
DTT在電泳中還有一個作用。過量DTT能打開多聚體內(nèi)的二硫鍵，使呈各個單體狀態(tài)，而在loading中去除DTT后，多聚體仍然保持原狀態(tài)。因此兩者對比可以分辨該蛋白是否含有多聚體形式。
結合我的實驗，我做的是有關纖維素酶基因的克隆與表達。應用的是家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)。
攜帶有纖維素酶基因片段的重組病毒構建好以后，將轉(zhuǎn)染細胞所獲得的達到一定滴度的重組病毒從皮下注射到家蠶體內(nèi)。
家蠶血淋巴中是否能表達纖維素酶?這是我目前所研究的重點。難點以及疑惑：家蠶血淋巴在空氣中容易被氧化，雖然低溫下可保持短時間內(nèi)不被黑化(即氧化)，但測酶活的時候需要經(jīng)過50度反應30分鐘這一步，所以我*次做的時候由于沒添加巰基乙醇或者DTT，所以溶液變黑了。