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細(xì)胞組分的化學(xué)反應(yīng)
點(diǎn)擊次數(shù)：521 發(fā)布時(shí)間：2016-9-26
細(xì)胞的組織化學(xué)方法，是研究細(xì)胞成分常用的方法之一。它是利用化學(xué)試劑與細(xì)胞內(nèi)的某些物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而在細(xì)胞局部形成有色沉淀物，再通過(guò)顯微鏡對(duì)組織內(nèi)的生物化學(xué)成分進(jìn)行定性、定位、定量研究。 一、Brachet反應(yīng)一顯示細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA (一)原理 細(xì)胞經(jīng)甲基綠一呱咯寧混合液處理后，其中的DNA和RNA出現(xiàn)不同的呈色反應(yīng)，一般認(rèn)為這是由于帶有負(fù)電荷的核酸對(duì)堿性染料呱咯寧和甲基綠具有親和力，且這兩種染料的作用有選擇性，甲基綠染高聚分子的DNA呈藍(lán)綠色，呱咯寧染低聚分子的RNA呈紅色。由此對(duì)細(xì)胞中的DNA和RNA進(jìn)行定位、定性、和定量分析。 (二)方法 l．接種Hela細(xì)胞于蓋片上并培養(yǎng)24～48小時(shí)，使長(zhǎng)成單層。 2．取出蓋片，用PBS(pH7.2)輕輕沖洗蓋片表面去除殘?jiān)?3．放入Carnoy固定液中固定l小時(shí)。 4．浸入甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液中30分鐘染色。 5．取出蓋片放入蒸餾水中輕輕漂洗2～3次(2～3秒鐘左右)，吸去水分。放入純丙酮中分色2～3秒鐘。 6. 放入l／2丙酮+1／2二甲苯中5秒鐘。 7．放入純二甲苯中透明5分鐘。8．滴一滴中性樹(shù)膠于載玻片上，將蓋片標(biāo)本面朝下封片。9．鏡下觀察（三）結(jié)果細(xì)胞質(zhì)被染成淺紅色，細(xì)胞核被染成藍(lán)綠色，而其中核仁被染成紫紅色。二、細(xì)胞內(nèi)堿性蛋白和酸性蛋白的顯示（一）原理由于不同的蛋白質(zhì)分子所帶的堿性和酸性基團(tuán)的數(shù)目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白質(zhì)分子所帶的凈電荷多少不同。如在生理?xiàng)l件下，整個(gè)蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷多，則為酸性蛋白質(zhì)；帶正電荷多，則為堿性蛋白質(zhì)。據(jù)此，可將標(biāo)本經(jīng)三氯醋酸處理提出核酸后，用不同pH值的固綠染液分別染色，細(xì)胞內(nèi)的酸性蛋白和堿性蛋白質(zhì)顯示出來(lái)。（二）方法1．以破壞脊髓法處死蟾蜍，將其腹面向上放人蠟盤(pán)中，剪開(kāi)胸腔，打開(kāi)心包。小心將心臟剪一小口，取心臟血一滴滴在干凈載玻片一端，推片，按此法制備二張血涂片，室溫晾干。2. 將涂片作好標(biāo)記放在70％乙醇中固定5分鐘，室溫晾干。3．放入5％三氯醋酸中60℃30分鐘，抽提出核酸。4．清水沖洗多次（3分鐘以上），以沖去痕跡的三氯醋酸。5．濾紙吸干玻片上水分。6. 一張片放入0.1％堿性固綠(pH8.0～8.5)中染色10～15分鐘,另一張片放入0.1％酸性固綠(pH2.0～2.5)染色5～10分鐘。7．清水沖洗，蓋上蓋片鏡檢。（三）結(jié)果經(jīng)堿性固綠染色片中，胞質(zhì)、核仁不著色，細(xì)胞核大部分被染成綠色，是為堿性蛋白質(zhì)存在處。經(jīng)酸性固綠染色片中，因胞質(zhì)和核仁中有酸性蛋白，被染成綠色。 三、細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶的顯示（一）原理過(guò)氧化物酶能把許多胺類(lèi)氧化為有色化合物，用聯(lián)苯胺處理標(biāo)本，細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色的聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變?yōu)樽厣a(chǎn)物，因而可以根據(jù)顏色反應(yīng)來(lái)判定過(guò)氧化物酶的有無(wú)或多少。（二）方法1．取小鼠一只，以頸椎脫位法將其處死，迅速剖開(kāi)其后肢暴露出股骨，將股骨一端斜向剪斷，用PBS緩沖液濕潤(rùn)過(guò)的注射器針頭吸出骨髓一滴滴到載玻片上。2．推片，室溫晾干。3．將涂片放入0.5％硫酸銅中浸30秒~1分鐘。4．取出涂片直接放入聯(lián)苯胺混合液中反應(yīng)6分鐘。5．清水沖洗，放入1％番紅溶液中復(fù)染2分鐘。6．清水沖洗，室溫晾干。7．鏡檢或封片后鏡檢。（三）結(jié)果涂片中可見(jiàn)一些細(xì)胞中存在著藍(lán)色或棕色顆粒，為過(guò)氧化物酶所在位置。 四、過(guò)碘酸雪夫反應(yīng)(PAS)——顯示細(xì)胞內(nèi)糖原 (一)原理 組織、細(xì)胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用PAS法來(lái)顯示，其化學(xué)基礎(chǔ)是利用過(guò)碘酸的氧化作用，打開(kāi)碳鏈形成醛，生成的醛基與Schiff試劑中的無(wú)色品紅反應(yīng)形成紫紅色化合物。 (二)方法 l．取l~2mm厚的肝組織塊，用Carnoy氏液4℃固定4～6小時(shí)。 2．乙醇脫水、二甲苯透明。石蠟包埋，切片。 3．用70％乙醇展片。 4．脫蠟：二甲苯(1)5分鐘→二甲苯(2)5分鐘→100％乙醇5分鐘→含1％火棉膠的乙醇液1分鐘→70％乙醇1分鐘。 5．直接浸入過(guò)碘酸酒精液反應(yīng)5～15分鐘，經(jīng)70％乙醇洗片刻。6．浸入Schiff氏酒精液反應(yīng)15分鐘。 7．亞硫酸水洗三次，以洗去多余的非特異性結(jié)合的色素，以及擴(kuò)散的染料。 8．流水沖洗3～5分鐘。 9．蒸餾水洗。 10．浸入Ehrlich蘇木精復(fù)染20~30秒，使細(xì)胞核著色。 11．脫水：95％乙醇3分鐘二次→100％乙醇3分鐘二次→二甲苯透明10分鐘二次。 12．加蓋片鏡檢或樹(shù)膠封固后鏡檢。 (三)結(jié)果 細(xì)胞中呈紫紅的顆粒即為糖原。