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細(xì)胞骨架系統(tǒng)的顯示和觀察
點(diǎn)擊次數(shù)：1002 發(fā)布時(shí)間：2017-2-6
細(xì)胞骨架(cytoskeleton)是指真核細(xì)胞胞質(zhì)中錯(cuò)綜復(fù)雜的纖維狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，主要包括微管（microtubule，MT，20~25 nm）和纖絲（filament）兩大類；另外，胞質(zhì)中還散布著一些3~6 nm的細(xì)小纖維。按纖維的直徑、組成成分以及組裝結(jié)構(gòu)的不同，纖絲又可分為微絲（microfilament，MF）、中間絲（intermediate filament，IF）和粗絲（thick filament，TF）三類。微絲是肌動(dòng)蛋白亞單位組成的螺旋狀纖維（F-actin），直徑為6~7 nm，又名肌動(dòng)蛋白絲，其長度不定，多分布在近細(xì)胞膜的下方。微絲在不同種類的細(xì)胞中，它們又與某些結(jié)合蛋白一起形成不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如張力纖維（stress fiber）、肌肉細(xì)絲、腸上皮絨毛軸心等。現(xiàn)在觀察微絲可以用電鏡、組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)等手段。本實(shí)驗(yàn)用普通光鏡觀察到細(xì)胞骨架，是因?yàn)楣羌芾w維成束分布、結(jié)構(gòu)經(jīng)染色后，有夸大作用。由于細(xì)胞經(jīng)TritonX-100抽提后剩下的主要是細(xì)胞骨架成分，使得顯現(xiàn)更清晰。
細(xì)胞骨架在通常情況下不穩(wěn)定：如低溫、高壓、餓酸處理等。當(dāng)用適當(dāng)濃度的TritonX-100處理細(xì)胞時(shí)，能溶解質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中及細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)，而細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)卻不被破壞顯得更清晰，M-緩沖液洗滌細(xì)胞，可以提高細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性，戊二醛固定能較好地保存細(xì)胞骨架成分，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色后，可使細(xì)胞骨架蛋白著色，而胞質(zhì)背景著色弱，有利細(xì)胞骨架纖維顯示。
1．實(shí) 驗(yàn) 目 的
1．1. 掌握考馬斯亮藍(lán)R250（coomassie brilliant blue R250）染細(xì)胞胞質(zhì)微絲的方法。
1．2. 對細(xì)胞內(nèi)微絲的分布有一個(gè)整體上的認(rèn)識(shí)。
2．實(shí) 驗(yàn) 原 理
考馬斯亮藍(lán)R250是一種普通的蛋白質(zhì)染料，它可以使各種細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)著色，并非特異地顯示微絲，但是由于有些細(xì)胞骨架纖維在該實(shí)驗(yàn)條件下不夠穩(wěn)定，例如微管；還有些類型的纖維太細(xì)，在光學(xué)顯微鏡下無法分辨，因此我們看到的主要是微絲組成的張力纖維，直徑約40nm左右。張力纖維形態(tài)長而直，常常與細(xì)胞的長軸平行并貫穿細(xì)胞全長。觀察微絲可以用電鏡、組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)等手段，本實(shí)驗(yàn)主要介紹用考馬斯亮藍(lán)R250顯示由微絲組成的張力纖維的實(shí)驗(yàn)方法。
染色時(shí)用的M-緩沖液，其中咪唑是緩沖劑，EGTA和EDTA螯合Ca2+離子，溶液中并提供Mg2+離子，在此低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且較為舒張。
3．實(shí) 驗(yàn) 用 品
3．1 材料 洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞或培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞。
3．2 試劑
3．2．1. 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖生物鹽水(PBS)配法
0.2mol/L Na2HPO4/KH2PO4緩沖液(pH7.3) 50 ml
NaCl 0.15 mol/L
重蒸餾水 至1000 ml
其中PB的配法: 0.2mo1/L Na2HPO4 77 ml
0.2mo1/L NaH2PO4 23 ml
3．2．2. M-緩沖液
咪唑(imidazole, pH6.7) 50 mmol/L
KC1 50 mmol/L
MgCl2 0.5 mmol/L
EGTA l mmol/L
EDTA 0.l mmol/L
巰基乙醇(mercaptoethanol) l mmol/L
甘油 4 mmol/L
用1 mol/L HCl調(diào)pH至7.2。