會(huì)員.png)
QQ交談
您所在位置：請(qǐng)輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機(jī)：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個(gè)性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://m.yimoshopping.cn/st236594/
線粒體的分離與觀察
點(diǎn)擊次數(shù)：1071 發(fā)布時(shí)間：2017-2-16
線粒體(mitochondria)是真核細(xì)胞中產(chǎn)生能量的重要細(xì)胞器。細(xì)胞中的能源物質(zhì)—脂肪、糖、部分氨基酸在此進(jìn)行zui終的氧化，并通過(guò)偶聯(lián)磷酸化生成ATP，供給細(xì)胞生理活動(dòng)之需。對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)與功能的研究通常是在離體的線粒體上進(jìn)行的。
制備線粒體時(shí)，可將組織勻漿液懸浮在懸浮介質(zhì)中進(jìn)行差速離心法進(jìn)行分離。在一定的離心場(chǎng)中（選用離心機(jī)的一定轉(zhuǎn)速），大小不一的顆粒沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的粘度。在一個(gè)均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時(shí)間，組織勻漿中的各種細(xì)胞器及其它內(nèi)含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時(shí)間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細(xì)胞器中zui先沉淀的是細(xì)胞核，其次是線粒體，其它更輕的細(xì)胞器和大分子可依次再分離。
懸浮介質(zhì)通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在—定程度上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性，在pH7.2 的條件下，亞細(xì)胞組分不容易重新聚集，有利于分離。整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)注意使樣品保持4℃，避免酶失活。
線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法。
三、實(shí)驗(yàn)用品
(一) 材料 小鼠12 只
（二）器材 冷凍高速離心機(jī)、解剖刀剪、小燒杯、冰浴、漏斗、尼龍網(wǎng)、玻璃勻漿器、PH 計(jì)、高壓滅菌鍋等。
（三）試劑 氯化鈉、詹納斯綠B、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、D(十)蔗糖、
甲醇、冰醋酸、雙蒸水、甘油、姬姆薩染料、KH2PO4 、Na2HPO4。
1．0.9%滅菌的生理鹽水。
2. 1%詹納斯綠B 染液，用0.9%滅菌的生理鹽水配制。
3. 0.25mol/L 蔗糖十0.01mo1/L Tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)：
0.1mol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris) 10ml
0.1mol/L 鹽酸8.4ml
加重蒸水到100ml
加蔗糖到0.25mol/L。
4. 0.34mol/L 蔗糖十0.01mol/L tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)
5. 固定液：甲醇：冰醋酸(9：1)
6. 姬姆薩染液（原液）：Giemsa 粉0.5g，甘油33m1，純甲醇33m1。先將Giemsa 粉置于研缽內(nèi)中，加少量甘油研磨至無(wú)顆粒，再將剩余甘油倒入混勻，56℃左右保溫2h 令其充分溶解，zui后加甲醇混勻，成為姬姆薩原液，保存于棕色瓶。
7. 姬姆薩染液（應(yīng)用液）：臨用時(shí)，吸出1ml 原液，用9ml 1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)作l0 倍稀釋。
8. 1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH6.8)：
l/15mol/L KH2PO4 50ml
l/15 mol/L Na2HPO4 50ml
四、實(shí)驗(yàn)操作
1. 制備小鼠肝細(xì)胞勻漿實(shí)驗(yàn)前小鼠空腹12h，拉頸處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干。稱(chēng)取肝組織2g，剪碎，用預(yù)冷到0～4℃的0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后在0～4℃條件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液將肝組織勻漿化，蔗糖溶液應(yīng)分?jǐn)?shù)次添加。勻漿液用200 目銅篩過(guò)濾備用。