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體外培養(yǎng)細胞
點擊次數(shù)：698 發(fā)布時間：2017-4-5
一、所謂細胞培養(yǎng)(Cell culture)是指細胞包括單個細胞在體外條件的生長。
組織培養(yǎng)的發(fā)展史已有近百年，zui初的組織培養(yǎng)是胚胎學和微生物學的引申，建立于無菌原則上，用天然體液（如胎汁、血漿）來維持從整體切下的組織塊，對細胞進行形態(tài)和功能的觀察。
通過許多學者大的改進和革新，培養(yǎng)基由天然動物血漿改為合成培養(yǎng)基，促進細胞生長物質(zhì)從胎汁改為動物血清?，F(xiàn)在*貯存的細胞約有萬種以上。組織培養(yǎng)不僅是細胞生物學必需的技術(shù)，也是分子生物學、腫瘤學、遺傳學和免疫學等學科必要的方法。
二．基本原理和方法
體外培養(yǎng)細胞的生存條件：
(一)營養(yǎng)。
體外培養(yǎng)細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)與體內(nèi)相同，主要有糖、氨基酸和維生素三大類。目前市面上銷售的合成培養(yǎng)基如1640、199等所含的氨基酸已足夠，但在使用合成培養(yǎng)基時，仍需加入一些天然成份，如人或動物的血清、血漿和胎汁等。目前主要使用血清，以牛血清為主。血清的生物效應早已證明，它含有多種促細胞生長因子、促貼附因子及其它活性物質(zhì)等。不僅能促進細胞增長且能幫助細胞貼壁。不同血清對細胞作用不同。以小牛血清，成年牛和馬血清次之。合成培養(yǎng)基中不加血清也能維持細胞生存，但不能很好生長，加入5%的血清，對大多數(shù)細胞來說，能維持細胞不死和緩慢生長，要使細胞正常生長，一般需加10～15%的小牛血清。每個批號血清使用前要加熱處理，一般滅活于56℃水浴中30分鐘，每個批號血清使用前要加熱處理，一般滅活于56℃水浴中30分鐘，每5分鐘搖一次。10%血清營養(yǎng)液能促進細胞增殖稱為生長液，2～5%血清培養(yǎng)液不能使細胞增殖而只能維持其生存稱為維持液。添加血清，雖利于細胞生長，但增加了不明成分，給分析實驗結(jié)果帶來了困難。因此，人們正在探索不用血清的無血清液并已取得了一定進展。
（二）環(huán)境
1．無菌：無菌是保證培養(yǎng)細胞生存的首要條件。培養(yǎng)液不僅對細胞是高營養(yǎng)物，對細菌和霉菌也是高度營養(yǎng)物，細胞培養(yǎng)中如污染微生物，其繁殖比細胞快且能產(chǎn)生毒素使細胞死亡，因此細胞培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵之一是防止污染。污染微生物可來源于組織培養(yǎng)液、器皿、組織本身、工作者本身。因此，培養(yǎng)室的空氣等要*消毒，所有操作均要嚴格實行無菌操作，各種物品拿入操作臺前應消毒，用灑精擦表面，用前于紫外線照；操作者洗手、泡手，酒精擦手，打開培養(yǎng)管前須在火焰上烙燒一下瓶口以使灰塵固定，操作時須將瓶、管斜放，吸管注入液體應避免和瓶口接觸，操作時禁止講話。
2.溫度：組織培養(yǎng)的zui適溫度為35-37℃，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝和生長將會受到影響，甚至導致死亡。培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力比高溫強。溫度增加2-3℃對細胞產(chǎn)生不良影響，使之在24小時死亡，溫度在43℃以上，細胞大多被殺滅，而低溫對細胞影響較小，細胞置于25-35℃時，細胞仍能生存和生長，但速度緩慢，放在4℃數(shù)小時之后，再置37℃培養(yǎng)，細胞仍能繼續(xù)生長。
3.氣體：氣體也是細胞生存的必需條件之一。所需的氣體主要有O2和CO2。O2參與三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量供給細胞生長、增殖和合成各種成分。CO2既是細胞代謝產(chǎn)物也是細胞所需成分。它主要與維持培養(yǎng)液pH值有直接關(guān)系。
4.pH值：多數(shù)細胞的適宜pH值為7.0-7.4，偏離此范圍對細胞可產(chǎn)生有害的影響。各種細胞對pH值的要求也不*相同，但總的來說，細胞耐酸性比耐堿性大一些。培養(yǎng)液中的緩沖體系主要是碳酸氫鹽/ CO2。細胞代謝產(chǎn)生的各種酸使pH下降，而培養(yǎng)液中的NaHCO3產(chǎn)生CO2排入空間又使pH增加。
5.培養(yǎng)器皿的處理：培養(yǎng)器皿處理的好壞與否對于細胞的貼壁生長影響很大，除少數(shù)懸浮生長的細胞外，絕大多數(shù)細胞屬于貼壁依賴性細胞或培養(yǎng)物。它們只有貼附于不起化學作用的物體的表面時，才能生長、生存或維持功能。目前，常用的器皿主要有玻璃及塑料二大類。玻璃器皿一般須用清潔液浸泡1至7天，清水沖洗20次后再用蒸餾水過洗2次，烤干備用。用前160℃高溫消毒2小時后使用。96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡4小時后，清水洗凈再用1N HCL浸泡4小時，用清水沖洗后再用蒸餾水漂洗，37℃干燥后，紫外線燈照射消毒；新橡皮塞須先用1/2NnaOH煮沸15分鐘，沖洗后再用4%HCL煮沸15分鐘，清水沖洗后用蒸餾水洗5次，煮沸10分鐘滅菌，或送高壓滅菌。
總之，細胞在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下可迅速增殖，但若遇到不良環(huán)境細胞會變圓，停止生長，甚至死亡，這是細胞的保護機制。綜上所述，細胞培養(yǎng)的基本條件主要包括了營養(yǎng)液、無菌條件、PH、溫度、氣體條件和培養(yǎng)器皿的清潔度。
三．常用的培養(yǎng)方法
根據(jù)培養(yǎng)物細胞生物學的特點，組織培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。亦可根據(jù)培養(yǎng)條件和器皿的不同而分為靜置培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)為zui常見的方式，細胞可為貼壁型細胞，亦可為懸浮的不貼壁細胞。