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RNAi技術(shù)初探
點(diǎn)擊次數(shù)：755 發(fā)布時(shí)間：2017-6-2
RNA干擾(RNA interference， RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的研究生物體基因表達(dá)、調(diào)控與功能的一項(xiàng)嶄新技術(shù)，它利用了由小干擾RNA(small interfering RNA， sirna)引起的生物細(xì)胞內(nèi)同源基因的特異性沉默(silencing)現(xiàn)象，其本質(zhì)是siRNA與對應(yīng)的mRNA特異結(jié)合、降解，從而阻止mRNA的翻譯。RNAi是生物進(jìn)化的結(jié)果，是生物體對病毒基因等外源核酸侵入的一種保護(hù)性反應(yīng)。它普遍存在于各種生物，具有抗病毒、穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子及監(jiān)控異常表達(dá)ｍRNA的生物學(xué)功能。RNA干擾現(xiàn)象不僅能提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷、的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定，基因治療等方面開辟一條新思路。
1 RNAi的歷史背景
20世紀(jì)20年代，人們發(fā)現(xiàn)，植物受到野生型病毒感染后，能產(chǎn)生對另一種親緣關(guān)系相近的病毒的抵抗力。而真正發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA(dsRNA)能引起基因沉默現(xiàn)象，則在1995年。當(dāng)時(shí)，Guo和Kemphues用反義rna技術(shù)阻斷秀麗新小桿線蟲(C.elegans)中parl基因的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)反義RNA具有抑制該基因表達(dá)的功能，同時(shí)正義RNA也同樣出現(xiàn)了類似的抑制效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)表明正義RNA和反義RNA均能阻抑基因功能表達(dá)，而且兩者的作用是相互獨(dú)立的，機(jī)制也各不相同。1998年，F(xiàn)ire和Mello等人發(fā)現(xiàn)dsRNA能夠特異地抑制C.elegans中的紋狀肌細(xì)胞unc-22基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)dsRNA所引起的基因沉默效應(yīng)要比單單應(yīng)用反義RNA或正義RNA強(qiáng)十幾倍。而且注射入C.elegans的性腺后，在其*子代中也誘導(dǎo)出了同樣基因的抑制現(xiàn)象，說明在原核生物中，RNAi具有可遺傳性。他們將這一現(xiàn)象稱為RNAi。因?yàn)镽NAi作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，所以又被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)或共抑制。
此后，又在果蠅、錐蟲、渦蟲、無脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、植物、真菌、斑馬魚及哺乳動(dòng)物等真核生物中發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象。不同領(lǐng)域中的發(fā)現(xiàn)促使人們思考它們之間的可能。RNAi在果蠅中得到證實(shí)的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子翻轉(zhuǎn)移位可啟動(dòng)RNAi，而轉(zhuǎn)座子翻轉(zhuǎn)移位所造成的同源基因沉默很似植物中的共抑制；在線飽霉實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)PTGS過程中所必須的蛋白QDE1與RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)同源，提示PTGS過程中可能涉及到RNA復(fù)制及調(diào)節(jié)作用。同樣在植物韌皮部注射dsRNA可遍及擴(kuò)散到整個(gè)植株體產(chǎn)生RNAi；更有趣的是，把線蟲浸潤到含有dsRNA液體中或喂養(yǎng)表達(dá)dsRNA的工程菌也可以誘發(fā)RNAi。這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進(jìn)化的早期階段。隨著研究的不斷深入，RNAi的機(jī)制正在被逐步闡明，而同時(shí)作為功能基因組研究領(lǐng)域中的有力工具，RNAi也越來越為人們所重視。
2 RNAi的作用機(jī)理
目前對RNAi的作用機(jī)理尚不清楚， RNAi是由dsRNA誘導(dǎo)的多步驟、多因素參與的過程，屬于基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，其中需要ATP的參與。通常認(rèn)為dsRNA由核酸內(nèi)切酶(RNA se Ⅲ)切割成21～23bp的siRNA (在果蠅RNA se Ⅲ 被稱為 dicer)，siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、螺旋酶)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物RISC，然后RISC再特異性地與ｍRNA的同源區(qū)結(jié)合，通過酶的作用使ｍRNA降解，而產(chǎn)生基因沉默。靶ｍRNA被破壞后， RISC還可以再作用于其它靶分子。siRNA還具有低分子質(zhì)量、低濃度、沉默信號可在細(xì)胞間傳遞甚至傳播至整個(gè)有機(jī)體以及可遺傳等特點(diǎn)。而大于30bp的dsRNA可引起機(jī)體非特異性干擾素樣反應(yīng)和蛋白激酶(PKP)的激活而使其被降解，從而大大減少了其對ｍRNA的抑制作用。
3 RNAi的特點(diǎn)
RNAi被美國科學(xué)雜志評為2001年科技突破之一，科學(xué)家對RNA干擾現(xiàn)象之所以表現(xiàn)出極大關(guān)注在于RNA干擾在基因功能和相關(guān)方面的研究中具有許多傳統(tǒng)方法*的特點(diǎn)和優(yōu)勢。RNAi有7個(gè)重要特征
3.1 RNAi是dsRNA介導(dǎo)的PTGS機(jī)制
在此過程中，注射該基因的內(nèi)含子或者啟動(dòng)子順序的dsRNA都沒有干涉效應(yīng)。翻譯抑制劑對RNAi不產(chǎn)生影響。
3.2高特異性
RNAi只能特異地降解與之序列相應(yīng)的單個(gè)內(nèi)源基因的mRNA，而其他mRNA的表達(dá)則不受影響。
3.3性
無論是在體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)中，僅需少量的dsRNA(幾個(gè)數(shù)量級濃度)就能有效的抑制靶基因表達(dá)，抑制的效率在低等動(dòng)物中>90%。這表明dsRNA介導(dǎo)的RNA干擾是一個(gè)以催化放大的方式進(jìn)行的。
3.4 dsRNA長度限制性
引發(fā)有效iRNA的dsRNA需要一個(gè)zui小的長度。dsRNA小片段如小于21～23nt(如10～15nt)，特異性將顯著降低，不能保證不與細(xì)胞內(nèi)非靶向基因相互作用，如遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于21～23nt，互補(bǔ)序列可能延伸，超出抑制范圍。
3.5 RNAi有濃度、時(shí)間雙重依賴性
dsRNA誘發(fā)的RNAi效應(yīng)的強(qiáng)度隨著其濃度的增高而增強(qiáng)。高濃度的dsRNA產(chǎn)生較多的siRNA，不僅能增強(qiáng)反應(yīng)體系的效應(yīng)，而且還能抵消ADARs(RNA依賴的腺苷脫氨酶)的作用。實(shí)驗(yàn)表明，RNAi在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中只能維持一段時(shí)間，干擾效應(yīng)通常出現(xiàn)在注射dsRNA 6h后，可持續(xù)72h以上。