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大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化
點(diǎn)擊次數(shù)：643 發(fā)布時間：2017-7-24
1.概 述在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob 基因,因此不能自行完成從一個細(xì)胞到另一個細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA 分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA 分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenent cells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA 分子通過復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant,即帶有異源DNA 分子的受體細(xì)胞)。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高,但CaCl2 法簡便易行,且其轉(zhuǎn)化效率*可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時,可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法為使用更廣泛。為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個重要因素：1. 細(xì)胞生長狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5 時,細(xì)胞密度在5×107 個/ml 左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒dna 應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA 的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA 的量過多或體積過大時,轉(zhuǎn)化效率就會降低。1ng 的cccDNA 即可使50μl 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下,DNA 溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是zui高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,分裝保存于干燥的冷暗處。
4. 防止雜菌和雜DNA 的污染：整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA 酶或雜DNA所污染, 否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA 的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH 菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2 處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS 質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS 質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過Amp 抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp 的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp 培養(yǎng)基上生長的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pBS。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH 菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2 處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS 質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS 質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過Amp 抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp 的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp 培養(yǎng)基上生長的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pBS。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。