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mRNA差別顯示技術(shù)[DDRT
點(diǎn)擊次數(shù)：829 發(fā)布時(shí)間：2017-8-2
隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，人們?cè)诖嘶A(chǔ)上建立起了一系列基于基因分離的新技術(shù)新方法。如mRNA差別顯示技術(shù)（DDRT-PCR）、以及進(jìn)一步改進(jìn)的代表性差示分析（RAD），抑制性扣除雜交（SSH）和交互扣除RNA差別顯示技術(shù)（RSDD）。
差別顯示ＰＣＲ是根據(jù)絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結(jié)構(gòu)，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。該方法的創(chuàng)始人Liang P和Pardee A根據(jù)Poly A序列起點(diǎn)前2個(gè)堿基除AA外只有12種可能性的特征，設(shè)計(jì)合成了12種下游引物，稱3′-錨定引物，其通式為5’-T11MN；同時(shí)為擴(kuò)增出polyA上游500bp以內(nèi)所有可能性的mRNA序列，在5′端又設(shè)計(jì)了20種10bp長的隨機(jī)引物。這樣構(gòu)成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增能產(chǎn)生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種，這一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細(xì)胞類型中所表達(dá)的全部mRNA。
差別顯示技術(shù)自1992年建立后，一直在不斷進(jìn)行著改進(jìn)。如在1994年，Ito等對(duì)3′端錨定引物的設(shè)計(jì)由固定兩個(gè)堿基變?yōu)橐粋€(gè)堿基固定的引物，這就使原來12種引物減至3種即可(5′Ｔ12Ｇ，5′Ｔ12Ａ，5′Ｔ12Ｃ)，這樣做減少了每個(gè)mRNA樣品對(duì)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)種類的需要，并且把由于簡并性引起的某些ＲＮＡ的代表性差和RNA數(shù)量過多現(xiàn)象降低到zui低程度；在隨后的兩年中，研究人員有在3′端引物和5′隨機(jī)引物末端分別加上了限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(如Hind III酶切位點(diǎn))，使得5′端引物條數(shù)改為8條，長度為13bp，而3′端引物則由18個(gè)堿基組成。這樣形成的24種引物對(duì)，經(jīng)計(jì)算機(jī)同源性分析表明同樣能覆蓋全部mRNA，使實(shí)驗(yàn)簡化，同時(shí)由于引物變長，使cDNA擴(kuò)增更為有效。有的實(shí)驗(yàn)室采用把Bakman公司的kit，其引物5′端為26bp，3′端為31bp，并加上了T3和T7兩端的測(cè)序引物，由儀器切割差異條帶后，再次擴(kuò)增，并通過熒光標(biāo)記，用計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)出結(jié)果。此外，許多學(xué)者針對(duì)該技術(shù)在****作中假陽性高等問題，還從設(shè)計(jì)對(duì)照、提取胞質(zhì)RNA、更換放射性標(biāo)記物以及改變PCR反應(yīng)條件等等方面提出了相應(yīng)解決方案，以求這一技術(shù)得到進(jìn)一步完善。
DD-PCR與示差篩選、扣除雜交相比,具有很多優(yōu)點(diǎn):
1)速度快,較易操作;
2)由于pcr擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用,使得低豐度mRNA的鑒定成為可能,且靈敏度高;
3)可同時(shí)比較兩種以上不同來源的mRNA樣品間基因表達(dá)的差異。
盡管差別顯示技術(shù)有以上諸多方面的優(yōu)點(diǎn),但在實(shí)際操作中仍存在一些問題,主要表現(xiàn)在:
1)出現(xiàn)差別條帶太多,假陽性率高達(dá)70%左右,重復(fù)性差,且對(duì)高拷貝數(shù)的mRNA具很強(qiáng)的傾向性;
2)擴(kuò)增條帶分子長度較短,一般在110～450bp之間。