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聚合酶鏈反應(yīng)[PCR]
點(diǎn)擊次數(shù)：719 發(fā)布時(shí)間：2017-8-14
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）即PCR技術(shù)是美國(guó)Cetus公司人類遺傳研究所的科學(xué)家K.B.Mullis于1983年發(fā)明的一種體外擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。PCR具有很高的特異性、靈敏度，在分子生物學(xué)、基因工程研究、某些疾病的診斷以及臨床標(biāo)本中病原體檢測(cè)等方面具有極為重要的應(yīng)用價(jià)值。
雙鏈DNA分子在接近沸點(diǎn)的溫度下解鏈，形成兩條單鏈DNA分子（變性），與待擴(kuò)增片段兩端互補(bǔ)的寡核苷酸（引物）分別與兩條單鏈DNA分子兩側(cè)的序列特異性結(jié)合（退火、復(fù)性），在適宜的條件下，DNA聚合聚利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷酸（dNTP），在引物的引導(dǎo)下，按5’-----3’的方向合成互補(bǔ)鏈，即引物的延伸。這種熱變性、復(fù)性、延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)。隨著循環(huán)的進(jìn)行，前一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，使產(chǎn)物的數(shù)量按2n方式增長(zhǎng)。從理論上講，經(jīng)過(guò)25-30個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106-109倍。
除上述典型的PCR反應(yīng)外，人們還根據(jù)各種用途設(shè)計(jì)了各種不同類型的特殊PCR。如利用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR），即利用組織mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后合成*鏈cDNA，以此為模板經(jīng)PCR合成特定目的基因；反向PCR，常規(guī)PCR允許擴(kuò)增兩條引物之間的DNA片段，而反向PCR則可以對(duì)靶DNA區(qū)域之外的兩側(cè)未知的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增；不對(duì)稱PCR使用的引物濃度不同，兩種引物濃度相差100倍，在zui初的20個(gè)循環(huán)中主要產(chǎn)物是雙鏈DNA，當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌暮螅邼舛纫镆龑?dǎo)的PCR反應(yīng)產(chǎn)生大量單鏈DNA分子，可用于DNA的序列測(cè)定；在PCR-ELISA中，將引物用地高辛、生物素或放射性同位素標(biāo)記，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用ELISA方法檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的靈敏度可提高百倍以上；采用定量PCR，即用熒光物質(zhì)標(biāo)記引物，根據(jù)反應(yīng)進(jìn)程中熒光變化情況，可以確定組織中mRNA含量，從而了解不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期組織特定基因的表達(dá)水平等。
影響pcr反應(yīng)結(jié)果的因素較多，主要包括
（1）模板的質(zhì)量：在制備模板DNA時(shí)通常需要使用蛋白變性劑及乙醇等有機(jī)溶劑，這些物質(zhì)可直接影響PCR反應(yīng)；另外當(dāng)模板DNA分子量很高時(shí)，解鏈不易，可用限制酶消化以改善擴(kuò)增效果；從理論上說(shuō)，一個(gè)模板DNA分子即可獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，模板濃度過(guò)高，PCR反應(yīng)的特異性下降，實(shí)際操作中可按1ng、0.1ng、0.01ng遞減的方式設(shè)置模板濃度對(duì)照。
（2）引物：引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計(jì)在PCR反應(yīng)中極為重要。要保證PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計(jì)要遵循以下幾條原則：
①引物的長(zhǎng)度以15-30bp為宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。應(yīng)盡量避免數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出是隨機(jī)的。
②引物的3’端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補(bǔ)，避免引物內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物在3’端不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。兩條引物間配對(duì)堿基數(shù)少于5個(gè)，引物自身配對(duì)若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對(duì)數(shù)不能超過(guò)3個(gè)由于影響引物設(shè)計(jì)的因素比較多，現(xiàn)常常利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)。