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HL50287.2 v.A

 

組織沉默調(diào)節(jié)蛋白1 （SIRT1）活性比色法定量檢測試劑盒

 

主要用途

 

組織沉默調(diào)節(jié)蛋白1 （SIRT1）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過比色探針對硝基苯胺標(biāo)記人工合成的乙?；痯53多肽底物，經(jīng)過SIRT1脫乙?；?，被位點特異性氨基肽酶水解，釋放黃色對硝基苯胺，即采用比色法來測定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）、核蛋白樣品、部分或*純化酶樣品中SIRT1的活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

人體組蛋白脫乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家屬分成三類共20多個蛋白：種類I（class I）與酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于細(xì)胞核中；種類II（class II）與酵母Hda1蛋白同源，包括HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于細(xì)胞核和細(xì)胞漿里；上述兩大種類的蛋白分子催化結(jié)構(gòu)域含有鋅，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。種類III（class III）為NAD⁺輔助因子必需，又稱為sirtuins，與酵母Sir2（Silent Information Regulator 2）同源，包括SIRT1至7等，為曲古菌素A（trichostatin A；TSA）不敏感型賴氨酸脫乙?；福?/span>lysyl-deacetylase）。催化賴氨酸脫乙?；?/span>反應(yīng)，以及由NAD⁺和乙酰（acetyl）基團(tuán)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的煙酰胺（nicotinamide）和O-乙酰ADP核糖（O-acetyl-ADP-ribose）。SIRT1位于細(xì)胞核內(nèi)，與酵母Sir2同源性高。其功能在于調(diào)節(jié)p53活性和抑制細(xì)胞凋亡?；谌斯ず铣傻囊阴；痯53（379至382氨基酸位點）多肽底物Ac-Arg—His-Lys-Lys（Ac）具有抗氨基肽酶切離的功能，首先使用比色染料對硝基苯胺（p-Nitroaniline；p-NA）來標(biāo)記乙?；痯53多肽底物，其次進(jìn)行脫乙?；?，后底物進(jìn)一步在氨基肽酶的催化酶解，釋放出具有強(qiáng)烈吸光值的黃色對硝基苯胺（波長405nm），由此來定量測定沉默調(diào)節(jié)蛋白1的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

                               Sirtl

Ac-Arg-His-Lys-Lys(Ac)-p-NA+NAD → Ac-Arg-His-Lys-Lys-p-NA+nicotinamide+O-acetyl-ADP-ribose

                             氨基肽酶

        Ac-Arg-His-Lys-Lys-p-NA  → Ac-Arg-His-Lys-Lys+p-NA

產(chǎn)品內(nèi)容

 

裂解液（Reagent A） 20毫升

分離液（Reagent B） 80毫升

清理液（Reagent C） 80毫升

萃取液（Reagent D） 5毫升

緩沖液（Reagent E）     3毫升

底物液（Reagent F）     100微升

終止液（Reagent G）     200微升

酶解液（Reagent H）     200微升

補(bǔ)充液（Reagent I）     500微升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

 

保存緩沖液（Reagent E）、底物液（Reagent F）、終止液（Reagent G）和酶解液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：用于清洗組織樣品

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

（微型）臺式離心機(jī)：用于組織細(xì)胞預(yù)處理

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

96孔板或100微升1厘米光徑比色皿：用于反應(yīng)和比色的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

 

一、樣品準(zhǔn)備

 

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升用戶自備的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過一晚
• 次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
• 加入1毫升裂解液（Reagent A），混勻組織樣品
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管 
• 強(qiáng)力渦旋震蕩10秒
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 加入4毫升預(yù)冷的分離液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1300g
• 小心抽去上清液
• 加入4毫升預(yù)冷的清理液（Reagent C）
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1300g
• 小心抽去上清液
• 小心加入100微升預(yù)冷的萃取液（Reagent D），混勻
• 轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 超聲處理30秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心移取上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測樣品（例如核蛋白或純化酶樣品等），置于冰槽里
• 設(shè)定好酶標(biāo)儀或分光光度儀（溫度為30℃）： 波長405nm，并置零 
• 緩沖液（Reagent E）置于室溫下均衡溫度

 

三、活性測定

 

• 終點法活性測定

 

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景空對照和待測樣品
• 分別移取55微升緩沖液（Reagent E）到相應(yīng)孔中
• 分別加入5微升底物液（Reagent F）
• 分別加入20微升補(bǔ)充液（Reagent I）或待測樣品（50微克核蛋白或200微克組織裂解萃取液總蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板30秒
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里，孵育60分鐘，避免光照
• 分別加入10微升終止液（Reagent G）
• 分別加入10微升酶解液（Reagent H）
• 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板30秒
• 在30℃培養(yǎng)箱里，孵育30分鐘
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到100微升1厘米光徑比色皿，在分光光度儀里檢測：獲得吸光讀數(shù)
• 活性計算：

 

• 酶標(biāo)儀檢測

 

【(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))×樣品稀釋倍數(shù)×0.10（體系容量;毫升）】÷【0.02（樣品容量；毫升）×10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）×1（反應(yīng)時間；小時）×0.6（光徑距離；厘米）】=單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升=單位/毫克

單位=微摩爾對硝基苯酚/小時

 

 

• 比色皿檢測

【（樣品讀數(shù)-背景讀數(shù)）×樣品稀釋倍數(shù)×0.10（體系容量；毫升）】÷【0.020（樣品容量；毫升）×10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）×1（反應(yīng)時間；小時）】=單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升=單位/毫克

單位=微摩爾對硝基苯酚/小時

 

 

• 酶動法活性測定

 

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景空對照和待測樣品

• 分別移取65微升緩沖液（Reagent E）到相應(yīng)孔中
• 分別加入5微升底物液（Reagent F）
• 分別加入20微升補(bǔ)充液（Reagent I）或待測樣品（50微克核蛋白或200微克組織裂解萃取液總蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板30秒
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里，孵育2分鐘，避免光照
• 分別加入10微升酶解液（Reagent H）
• 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板5秒
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到100微升1厘米光徑比色皿，在分光光度儀里檢測：間隔5分鐘，讀數(shù)6次（共30分鐘）――獲得吸光讀數(shù)
• 活性計算：

 

• 酶標(biāo)儀檢測

【（樣品讀數(shù)-背景讀數(shù)）×樣品稀釋倍數(shù)×0.10（體系容量；毫升）】÷【0.02（樣品容量；毫升）×10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）×30（反應(yīng)時間；分鐘）×0.6（光徑距離；厘米）】=單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升=單位/毫克

單位=毫摩爾對硝基氨酚/分鐘

 

• 比色皿檢測

【（樣品讀數(shù)-背景讀數(shù)）×樣品稀釋倍數(shù)×0.10（體系容量；毫升）】÷【0.020（樣品容量；毫升）×10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）×30(反應(yīng)時間；分鐘】=單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升=單位/毫克

單位=微摩爾對硝基苯酚/分鐘

  

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 樣品處理時，避免使用蛋白酶抑制劑、PMSF、烷基胺（alkyl amine）等
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行比色測定
• 濾波器可以使用波長400nm替代405nm
• 測定值由低到高變化；酶動法測定可以持續(xù)60分鐘
• 測定值吸光讀數(shù)越高，表明酶活性越高
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 待測樣本為核蛋白樣品，其蛋白濃度為50微克/20微升；待測樣本為組織裂解懸液，其蛋白濃度為200微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 沉默調(diào)節(jié)蛋白1單位活性定義為：在30℃，pH 8.0條件下，每分鐘內(nèi)能夠釋放1微摩爾對硝基苯酚所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列組蛋白脫乙酰基酶檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感