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主要用途

 

植物氫ATP酶（H^＋-ATPase）總活性酶連續(xù)反應光譜法定量檢測試劑是一種旨在使用氫ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應系統(tǒng)，在排除其它ATP酶干擾的情況下，受到氫ATP酶的水解產(chǎn)生的ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光譜法測定其氧化后吸光峰值（NADH濃度）的變化，以此進行測算單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等H^＋-ATP酶的特異性活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應優(yōu)化，檢測敏感。

 

技術(shù)背景

 

氫ATP酶（H^＋-ATPase；EC3.6.3.6），又稱為質(zhì)子或氫離子轉(zhuǎn)位ATP酶（Proton-Translocating ATPases），在生物能量傳導過程中起著重要作用。其分成三類：質(zhì)膜型（plasma membrane type或P型）、真細菌型（eubacterial type或F型）和囊/液泡型（vacuolar type或V型）。質(zhì)膜型存在于植物、酵母和胃酸分泌型囊泡的質(zhì)膜上，約100kd蛋白；真細菌型存在于葉綠體、線粒體和細菌上，由疏水的膜部分和親水的催化部分組成；囊/液泡型存在于真核生物細胞器的囊泡系統(tǒng)。其中植物質(zhì)膜氫ATP酶，100kd分子量，是植物細胞膜上重要的功能酶，為植物生命活動的主要酶之一。液泡型氫ATP酶是V型ATP酶的主要成員，400至600kd，含有胞漿復合體（V1）和胞膜復合體（V0），通過產(chǎn)生電子泵，轉(zhuǎn)移質(zhì)子，是微粒體和溶酶體酸性化，同時提供次級活性轉(zhuǎn)運體的動力。氫ATP酶催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機磷。這一去磷酸化反應釋放出能量，成為細胞生命代謝的能源。同時利用細胞內(nèi)ATP釋放的能量逆向跨質(zhì)膜把質(zhì)子轉(zhuǎn)運出細胞，產(chǎn)生并保持細胞膜或細胞器兩側(cè)氫離子的電化學梯度，為一系列次級轉(zhuǎn)運體和通道蛋白對各種營養(yǎng)物質(zhì)及離子的跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運提供能量。植物氫ATP酶還參與細胞內(nèi)pH水平、細胞伸長、氣孔開閉、以及植物對環(huán)境的應激反應等多種生理過程的調(diào)節(jié)。基于底物ATP，在排除其它，包括鈣（EGTA處理）、鈉鉀（烏本苷；ouabain處理）和氫鉀（奧美拉唑；omeprazole）等ATP酶的干擾下，受到氫ATP酶的水解，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來定量分析氫ATP酶的特異活性。其反應系統(tǒng)為：

 

H^＋-ATPase

 ATP  +  H2O  →    ADP  +  Pi

  

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate +  ATP

               

lactate dehydrogenase

pyruvate +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺

    （高吸收峰）    （低吸收峰）

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）         60毫升

裂解液（Reagent B）             20毫升

緩沖液（Reagent C）         20毫升

酶促液（Reagent D）            500微升

反應液（Reagent E）            2.5毫升

底物液（Reagent F）          2.5毫升

陰性液（Reagent G）            1毫升

產(chǎn)品說明書                1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于反應孵育

比色皿：用于光譜分析的容器

分光光度儀：用于光譜分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光；緩沖液（Reagent C）室溫下預熱。然后進行下列操作。

 

一、 樣品準備

 

1． 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定組織重量 

2． （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入適量的（1克組織需要3毫升）清理液（Reagent A）清洗1次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 放進一個預冷的15毫升錐形離心管

6． 加入預冷的1毫升裂解液（Reagent B）

7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

8． 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）

9． 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

10． 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管

11． （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

12． 即刻移入到1.5毫升離心管

13． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

14． 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

二、測定準備

 

1． 準備好待測樣品（例如植物組織裂解樣品等），置于冰槽里 

2． 設定好分光光度儀（溫度為28℃）：波長為340nm，間隔5分鐘，讀數(shù)7次（共30分鐘），并置零

 

三、 背景對照測定

 

1． 移取730微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升酶促液（Reagent D）

3． 加入100微升反應液（Reagent E）

4． 加入100微升底物液（Reagent F）

5． 放進28℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入50微升陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘

 

四、 樣品活性測定

 

1． 移取730微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升酶促液（Reagent D）

3． 加入100微升反應液（Reagent E）

4． 加入100微升底物液（Reagent F）

5． 放進28℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入50微升待測樣品（注意：100微克總蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘

 

五、 計算樣品活性

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 10或30（反應時間，分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

或者

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.1（樣品重量；毫克）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 10或 30（反應時間，分鐘）]＝單位/毫克 

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 注意事項

 

1． 本產(chǎn)品為21次操作，包括背景對照測定

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 建議樣品忌用磷酸緩沖溶液、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等  

5． 加入樣品啟動反應后3秒內(nèi)即刻光譜測定

6． 反應測定值由高到低變化；測定可以持續(xù)30分鐘

7． 測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數(shù)高于10分鐘或30分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性

8． 光譜測定后，比色皿須清洗*

9． 建議待測樣本總蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調(diào)整（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）

10． 樣品特異活性是指排除其它，包括鈣（EGTA處理）、鈉鉀（烏本苷；ouabain處理）、氫鉀（奧美拉唑；omeprazole）等ATP酶的干擾后的氫ATP酶活性

11． 氫ATP酶活性單位濃度定義：在28℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

12． 本公司提供系列ATP酶類分析技術(shù)產(chǎn)品

 

質(zhì)量標準

 

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準確