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真菌/酵母細(xì)胞線粒體損傷/氧化熒光測定試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent C），混勻后，將染色工作液置入暗室里。同時(shí)開啟熒光顯微鏡或熒光光度儀。然后進(jìn)行下列操作。

• 活體染色
• 準(zhǔn)備好1毫升新鮮的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 107細(xì)胞/毫升）
• 移入到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟5至7一次
• 加入xx毫升上述配制的染色工作液，充分混勻（注意：參見注意事項(xiàng)6）
• 放進(jìn)20℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx微升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察（定性檢測）：
• 移出5微升在載玻片上，放上蓋玻片
• 即刻進(jìn)行載玻片壓片（選擇下列其中一種）

（A）激發(fā)波長580nm，散發(fā)波長630nm

紅光減弱，表明活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）

（B）激發(fā)波長495nm，散發(fā)波長519nm

綠光減弱或降低，表明活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）

• 或使用熒光分光光度儀

• 移取500微升染色后的細(xì)胞樣品到用戶自備的1毫升比色皿
• 加入xx微升清理液（Reagent A）
• 上下傾倒混勻
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀測讀：濾波器激發(fā)波長580nm，散發(fā)波長630nm或?yàn)V波器激發(fā)波長495nm，散發(fā)波長519nm：活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）――相對熒光單位（RFU）降低

• 固定染色

• 準(zhǔn)備好1毫升新鮮的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 107細(xì)胞/毫升）
• 加入到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟5至7一次
• 加入xx毫升－20℃預(yù)冷的固著液（Reagent D），混勻
• 放進(jìn)－20℃冰箱里孵育20分鐘
• 加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟11至13二次
• （選擇步驟）置于100瓦超聲儀下，功率20％，猝擊5秒一次（分離集聚一起的細(xì)胞）
• 加入xx毫升上述配制的染色工作液，充分混勻（注意：參見注意事項(xiàng)6）
• 放進(jìn)20℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx微升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察（定性檢測）：
  • 移出5,微升在載玻片上，放上蓋玻片
  • 即刻進(jìn)行載玻片壓片（選擇下列其中一種）

（A）激發(fā)波長580nm，散發(fā)波長630nm

紅光減弱，表明活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）

（B）激發(fā)波長495nm，散發(fā)波長519nm

綠光減弱或降低，表明活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）

• 或使用熒光分光光度儀

• 移取500微升染色后的細(xì)胞樣品到用戶自備的1毫升比色皿
• 加入xx微升清理液（Reagent A）
• 上下傾倒混勻
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀測讀：濾波器激發(fā)波長580nm，散發(fā)波長630nm或?yàn)V波器激發(fā)波長495nm，散發(fā)波長519nm：活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）――相對熒光單位（RFU）降低