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精子DNA吖啶橙（acridine orange）熒光檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

精子DNA吖啶橙（acridine orange）熒光檢測(cè)試劑是一種旨在使用吖啶橙染料使單鏈和雙鏈DNA呈現(xiàn)不同熒光，確定精子染色質(zhì)質(zhì)量或DNA損傷的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種動(dòng)物或人體精子細(xì)胞以及凍存精子細(xì)胞。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)便，性能穩(wěn)定，熒光清晰。

技術(shù)背景

在男科學(xué)（Andrology）中，精子（spermatozoa）分析提供了精子生成（spermatogenesis）、精子壽命、以及生育能力的基礎(chǔ)信息。其中精子的活力（vitality）、運(yùn)動(dòng)能力（motility）、授精潛力（fertilizing potential）、膜結(jié)構(gòu)或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性（integrity）、頂體反應(yīng)（acrosomal reaction）功能的評(píng)價(jià)是精子分析的重要指標(biāo)，也是決定人工受孕或體外授精（in vitro fertilization；IVF）的重要參數(shù)。精子DNA損傷或染色質(zhì)質(zhì)量是不育癥的主要因素之一。使用陽(yáng)離子三環(huán)胺熒光染料吖啶橙（Acridine orange；AO）染色技術(shù)，是精子染色質(zhì)分析和授精效率評(píng)價(jià)的常用的方法?；谡＞蛹?xì)胞的染色質(zhì)完整性和DNA雙鏈特性，作為DNA染色劑之一的吖啶橙與正常非變性DNA，即雙鏈DNA嵌合（intercalate）時(shí)，呈現(xiàn)綠色熒光（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm）；而與變性DNA，即單鏈DNA結(jié)合時(shí)，呈現(xiàn)紅色熒光（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，散發(fā)波長(zhǎng)630nm），以此定量分析精子質(zhì)量或DNA損傷。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）                                      毫升
固著液（Reagent B）                                      毫升
染色液（Reagent C）                                      毫升
產(chǎn)品說明書                                                    1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent C）避免光照，有效保證6月
  
用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：用于細(xì)胞計(jì)數(shù)
載玻片和蓋玻片：用于精子細(xì)胞爬片
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察染色的精子細(xì)胞
細(xì)胞流式儀：用于分析染色的精子細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

一、細(xì)胞流式儀分析

1．移取新鮮獲得的1毫升精液（30分鐘至1小時(shí)內(nèi)）到1.5毫升離心管
2．放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g 
3．小心抽去上清液
4．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
5．在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)：1 × 107精子細(xì)胞/毫升
6．放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g 
7．小心抽去上清液
8．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟4至7一次（不包括實(shí)驗(yàn)步驟5）
9．加入xx微升染色液（Reagent B），混勻顆粒群
10．室溫下孵育10分鐘，避免光照
11．放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g 
12．小心抽去上清液
13．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
14．放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g 
15．小心抽去上清液
16．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟13至15一次
17．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
18．即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀雙通道分析：觀察10000個(gè)細(xì)胞以上，200細(xì)胞/秒；激發(fā)波長(zhǎng)200mW，散發(fā)波長(zhǎng)16 mW

激發(fā)波長(zhǎng)    488nm    488nm
匹配熒光染料    異硫氰酸熒光素（FITC）    藻紅蛋白（phycoerythrin；PE）
熒光顏色    綠色    紅色
散發(fā)波長(zhǎng)    530    630
流式儀通道    FL1    FL3
熒光增強(qiáng)    正常精子DNA    異常精子DNA
19．細(xì)胞流式儀檢測(cè)正常精子DNA（雙鏈DNA）參考圖像如下（X軸：FL3；Y軸：FL1；R1左下角為細(xì)胞碎屑；R2為正常精子細(xì)胞；R3為異常精子細(xì)胞；R4為未成熟精子細(xì)胞）

二、熒光顯微鏡分析

1．移取新鮮獲得的1毫升精液（30分鐘至1小時(shí)內(nèi)）到1.5毫升離心管
2．放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g 
3．小心抽去上清液
4．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
5．在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)：1 × 107精子細(xì)胞/毫升
6．放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g 
7．小心抽去上清液
8．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟4至7一次（不包括實(shí)驗(yàn)步驟5）
9．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
10．即刻移取20微升到潔凈的載玻片一端
11．用蓋玻片或另一個(gè)載玻片推片
12．置于空氣中涼干
13．加上xx微升固著液（Reagent B），覆蓋樣品表面
14．室溫下孵育2小時(shí)
15．小心抽去固著液
16．小心加上xx微升染色液（Reagent C），覆蓋樣品表面
17．室溫下孵育5分鐘，避免光照
18．小心抽去染色液
19．小心加上xx微升清理液（Reagent A），覆蓋樣品表面
20．小心抽去清理液
21．蓋上蓋玻片
22．即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)（注意：每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)精子）
23．分析結(jié)果（參考圖）
觀察紅色熒光：濾波器激發(fā)波長(zhǎng)488nm，散發(fā)波長(zhǎng)630nm ――可見黃色、桔紅色至紅色熒光，表明精子
DNA損傷包括單鏈DNA

觀察綠色熒光：濾波器激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm ――可見綠色熒光，表明精子DNA正常 

注意事項(xiàng)

1．本產(chǎn)品為50次操作
2．操作時(shí)須戴手套
3．樣品檢測(cè)前，建議在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)
4．精子細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)乘上稀釋倍數(shù)104。標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器（Hemocytometer）的計(jì)算方法是：
1毫米方塊的細(xì)胞計(jì)數(shù)X 104（稀釋倍數(shù)）＝實(shí)際細(xì)胞數(shù)/毫升
5．染色完成后，即刻進(jìn)行檢測(cè)分析，否則由于其毒性導(dǎo)致精子DNA異常
6．如果流式細(xì)胞儀出現(xiàn)干擾，建議使用630nm散發(fā)波長(zhǎng)，或進(jìn)行補(bǔ)償處理，建議使用誘導(dǎo)處理樣品：10單位DNase I/毫升37℃孵育10分鐘或直接70℃孵育30分鐘
7．本產(chǎn)品常用于凍存精子細(xì)胞的檢測(cè)分析
8．本產(chǎn)品可以用于精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（Sperm Chromatin Structure Assay；SCSA），分析參數(shù)如下：

    %DFI    %HDS
名詞解釋    DNA斷裂指數(shù)
DNA Fragmentation Index    DNA著色程度
High DNA Stainability
相同命名    COMP αt    HIGRN
計(jì)算方法    紅色熒光：紅色＋綠色熒光之比    高亮綠色熒光
參考值    正常人：小于15％    正常人：小于10％
    閾值：小于30％    閾值：小于15％
    高生育力：0－15％    
    中等生育力：16－27％    
    低或差生育力：27－30％    
參數(shù)意義    DNA損傷程度    精子成熟程度

9．本公司提供系列發(fā)育生物學(xué)相關(guān)檢測(cè)試劑產(chǎn)品
 
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰