Benzonase Nuclease高活力核酸酶

——消滅核酸，拒絕污染

1. 前言

核酸污染是生物樣本制備中常常遇到的問題。在蛋白純化的過程中，如果您提取的蛋白粘度很高、蛋白純化的得率很低、蛋白檢測(cè)的結(jié)果很差，那么您的樣本可能遭受了核酸污染。

如何去除核酸？超聲法和DNase/RNase酶法是常用的方法，但存在諸多缺陷（表1）。

表1 核酸去除，超聲法與DNase/RNase酶法優(yōu)缺點(diǎn)

為了、可重復(fù)性的去除核酸，建議您使用翊圣核酸酶（Benzonase Nuclease）。

2. 產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

Benzonase Nuclease，是一種來源于Serratia Marcescen的基因工程酶，以二聚體形式存在，包含2個(gè)*相同的亞基，單個(gè)亞基的分子量約為30 kD，因其能降解所有形式的DNA和RNA（包括單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀、天然以及變性的核酸），且不具有堿基識(shí)別特異性，所以又稱核酸酶或廣譜核酸酶。不僅可應(yīng)用在科研研究中作為生物樣本去除核酸干擾的酶制劑；還可應(yīng)用于疫苗工業(yè)、蛋白和多糖類制藥工業(yè)，去除宿主殘留核酸，提高制品生物功效。

圖1 核酸酶結(jié)構(gòu)圖

核酸酶，作為一種酶，其zui重要的指標(biāo)是活力和純度。翊圣生物選用進(jìn)口原料，提供活力高于250 U/μL，比活高于1.0×10⁶ U/mg蛋白，零內(nèi)毒素污染，零蛋白酶污染，且每批次均經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)量控制和功能驗(yàn)證的核酸酶，可保證、可重復(fù)性的降解所有形式的核酸，非常有助于防止蛋白凝集、降低蛋白溶液粘度、提高蛋白得率、提高病毒純化效率、改善蛋白電泳分辨率以及提高高通量測(cè)序質(zhì)量等。

               « 降解所有形式的DNA和RNA

               « 無蛋白酶、內(nèi)毒素污染

               « 廣泛的試劑兼容性

               « 超高的核酸消化活力

               « 每批次產(chǎn)品嚴(yán)格質(zhì)保與功能驗(yàn)證

               « 可有效應(yīng)用于：

                               蛋白、病毒及其他生物樣本的純化

                               降低由核酸引起的樣本粘度

                               電泳、色譜、NGS、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)樣本的制備

3. 產(chǎn)品性質(zhì)

核酸酶消化核酸的作用原理為水解核苷酸間的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生含3-8個(gè)堿基的5'-單磷酸寡核苷酸。在非常廣泛的條件下，核酸酶都能保持很高的穩(wěn)定性和消化活力，這使其能夠與多種細(xì)胞裂解液，如RIPA，或含有多種離子和非離子型去污劑、還原劑的蛋白提取試劑等兼容。表1中列舉了核酸酶可發(fā)揮核酸消化作用的部分條件參數(shù)。除此之外，核酸酶還可耐受6 M Urea，0.1 M Guanidine HCl，0.4% Triton X100，0.1% SDS，1 mM EDTA，1 mM PMSF，0.4% Sodium deoxycholate。

表2 核酸酶作用條件

注：1）zui適條件為核酸酶釋放≥90%活力的條件，可作用條件為核酸酶釋放≥15%活力的條件；2）核酸酶活力定義為在37℃，pH 8.0反應(yīng)條件，2.625 mL反應(yīng)體系中，在30 min內(nèi)使△A₂₆₀吸收值變化1.0（相當(dāng)于*消化37 μg鮭魚精DNA成為寡核苷酸）所用的酶量定義為一個(gè)活性單位（U）。

4. 產(chǎn)品前沿應(yīng)用

   核酸酶除了可以應(yīng)用于常規(guī)的蛋白抽提、純化，提高后續(xù)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)（如Western blotting，Co-IP等）的效果外，還可應(yīng)用于NGS樣本制備、蛋白組學(xué)樣本制備等前沿研究中。

1） 核酸酶應(yīng)用于HIV病毒NGS樣本制備

NGS應(yīng)用于HIV患者的監(jiān)控，可獲得HIV病毒耐藥變異信息，預(yù)測(cè)輔助受體的動(dòng)向，為患者調(diào)整治療方案，增加*。但由于HIV病毒變異速度極快，亞型多樣，獲取HIV病毒基因的樣本并非易事。研究者提供了一種可獲得HIV測(cè)序文庫的方案HIV-SMART，其中核酸酶的運(yùn)用，可顯著提高HIV病毒測(cè)序覆蓋度，且不影響病毒核酸的回收率。

圖2 NGS coverage plots of CHU1756 with (+) and without (−) benzonase pretreatment. Sequence coverage dramatically increased from 9% to 63% and from 55% to 83% with 100 nM and 1 μM N6 primer mixtures, respectively. ^[1] 

2） 核酸酶應(yīng)用于核蛋白質(zhì)組學(xué)研究

蛋白質(zhì)組學(xué)研究是后基因組時(shí)代的研究熱點(diǎn)，其常規(guī)研究技術(shù)為與質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)技術(shù)相結(jié)合的雙向電泳技術(shù)（2-DE）。在核蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，大量的核酸常會(huì)非特異性結(jié)合帶正電荷的蛋白，影響蛋白根據(jù)自身電荷性質(zhì)在等點(diǎn)聚焦電泳中的分布，成為影響2-DE成功的重要因素之一。研發(fā)人員在優(yōu)化核蛋白組學(xué)樣本制備過程中發(fā)現(xiàn)，在樣本中添加一定量的核酸酶，可有效去除核酸干擾，改善蛋白質(zhì)的分離效果，增強(qiáng)2-DE的分辨率。

圖3 Representative 2DE images of mouse brain nuclear proteins prepared with (A) and without (B) Benzonase addition. ^[2]

5. 目前使用的課題組超過200個(gè)

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)群體微生物研究中心，浙江大學(xué)藥學(xué)院，中國科學(xué)院動(dòng)物研究所膜生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中科院生物物理所生物大分子國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心，清華大學(xué)合成與系統(tǒng)生物學(xué)中心，中科院上海藥物研究所，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所，復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海市調(diào)控生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等單位的課題組。

6. 文獻(xiàn)引用

[1] Berg M G, Yamaguchi J, Alessandri-Gradt E, et al. A pan-HIV strategy for complete genome sequencing[J]. Journal of clinical microbiology, 2016, 54(4): 868-882.

[2] Jankowska U, Latosinska A, Skupien-Rabian B, et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain[J]. Journal of neuroscience methods, 2016, 261: 1-9.

[3] Kulkarni P S, Sahai A, Gunale B, et al. Development of a new purified vero cell rabies vaccine (Rabivax-S) at the serum institute of India Pvt Ltd[J]. Expert Review of Vaccines, 2017, 16(4): 303-311.

[4] Rai T S, Adams P D. Chapter Fourteen-ChIP-Sequencing to Map the Epigenome of Senescent Cells Using Benzonase Endonuclease[J]. Methods in enzymology, 2016, 574: 355-364.

[5] Yang Z, Li M, Chen W, et al. The smart solution for DNA removal in biopharmaceutical production by benzonase endonuclease[J]. Journal of Applied Virology, 2013, 2(1).

7. 常見問答

Q. 產(chǎn)品應(yīng)如何稀釋？

A：正常建議稀釋比例(終濃度)為1:1000-1:20000，其中時(shí)間、溫度、稀釋比例為影響反應(yīng)的正面因素。

Q. 產(chǎn)品能否可以減少用量？

A：如希望減少用量，可酌情提高反應(yīng)溫度或延長時(shí)間。

Q. 使用該產(chǎn)品進(jìn)行消化反應(yīng)的抑制因子有哪些？

A：在含有以下物質(zhì)的體系中，核酸酶的活性會(huì)降低50%或以上：>150 mM一價(jià)陽離子，>100 mM磷酸鹽，>100 mM硫酸銨，>100 mM鹽酸胍，>0.1% SDS，>1% Triton X-100，>1% Tween 20。

Q. 怎樣滅活核酸酶？如何去除？

A：采用EDTA螯合金屬離子會(huì)可逆地抑制核酸酶活性，條件會(huì)造成不可逆失活，例如100 mM NaOH，70℃處理30 min等。核酸酶可采用陰離子交換柱或氣相色譜法從目的產(chǎn)物中分離出去。

Q. 核酸酶與蛋白酶抑制劑混合物是否兼容？

A：核酸酶與不含EDTA的蛋白酶抑制劑混合物兼容。若含有EDTA且濃度>1 mM時(shí)，會(huì)抑制核酸酶活性，建議：如果必須加EDTA，按照2倍EDTA濃度補(bǔ)加Mg²⁺。

Q. 產(chǎn)品的用量是多少？

A：需要根據(jù)重懸菌體所需裂解液的體積來確定需要酶的量。若普通蛋白純化，則需要濃度為25 U/mL；核蛋白則需要100 U/mL；病毒表達(dá)蛋白純化需要濃度為12.5 U/mL；疫苗產(chǎn)品需要量為0.9-1.1 U/mL。

Q. 產(chǎn)品的穩(wěn)定性如何，如果不小心在室溫放置幾天后，酶活性會(huì)受到怎樣的影響？

A：室溫2-3天，對(duì)活力影響不大。

Q. 核酸酶能在尿素環(huán)境消化核酸嗎？

A：核酸酶在尿素濃度為6 M時(shí)活性先增加，隨著時(shí)間延長活性又有降低；在尿素為7 M時(shí)，核酸酶15分鐘后出現(xiàn)變性并失活。但是在酶失活前多數(shù)核酸已經(jīng)降解了。可通過提高核酸酶使用濃度補(bǔ)償7 M尿素的影響。

8. 價(jià)格對(duì)比

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圖4 Yeasen核酸酶價(jià)格優(yōu)勢(shì)（25 KU規(guī)格）

9. 訂購信息

10. 相關(guān)產(chǎn)品推薦

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