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熒光定量PCR實驗是分子實驗室常用的一項技術。持續(xù)關注小翊的應該都掌握了高質(zhì)量cDNA的獲取方法，引物設計指南以及反應體系的配制技巧（還未get的小伙伴戳文末鏈接），然而上機時，發(fā)現(xiàn)和別人的反應條件不一致卻又不敢動儀器？本期小翊將帶你玩轉qPCR儀器的設置！
目前市面上的qPCR儀器種類五花八門，但基本上儀器的設置都相對一致。我們以ABI 7500為例進行介紹。
- 反應板設置
- 實驗目的選擇：我們將實驗命名為“Yeasen”，進行“Quantitation： Δ Δ Ct”
實驗。
- 實驗方法選擇：如選用SYBR Green標記方法， 標準程序。
- 目的基因和模板的設置：每個Target和Sample命名，Target包括目的基因、內(nèi)參基因，Sample包括實驗組、對照組、負對照組。
- 反應孔的設置：根據(jù)樣品的排布選中面板上的加樣孔，勾選左邊對應的目的基因及模板。
注意：不應為了方便將所有孔選成同一個Target同一個Sample，這樣排布會造成比較大的風險。我們通過下面的例子進行說明：
（圖源自網(wǎng)絡）
我們同一塊板上同時擴增兩個基因，而布孔時選成同一個Target，那么儀器默認的都是同一個閾值，假如布孔時都選成Target1，紅色這條閾值線對于Target1是合理的，但對于Target2則不合理，因為這時已經(jīng)不在指數(shù)擴增期，得到的Ct值并不可信。
- 反應程序設置
- 擴增程序
- 預變性
qPCR的模板可以是cDNA或gDNA，預變性這一步可以使雙鏈DNA或cDNA-RNA結合物解鏈，以利于引物更好的和模板結合。另外在使用熱啟動Taq酶的反應中，還可激活Taq酶，從而使反應得以順利進行。如Yeasen Hieff系列定量產(chǎn)品的預變性設置為95℃ 5min。
- 變性
qPCR反應的產(chǎn)物比較短，一般10-30s的變性時間就已足夠。
- 退火/延伸
qPCR反應可以將退火與延伸兩步進行合并。條件需要根據(jù)引物和目的基因的長度進行調(diào)整，根據(jù)qPCR引物設計原則，引物的Tm值在60℃左右，因此這一步的溫度一般可設為60℃。時間還需根據(jù)儀器使用要求進行設置，如ABI StepOne、Bio-Rad CFX96、Roche LightCycler 480至少需要設置30s，而ABI 7500則至少需要設置34s。
- 循環(huán)數(shù)
循環(huán)階段從變性到退火、延伸，循環(huán)數(shù)一般設為40。
- 熒光信號采集
對于染料法而言，兩步法檢測的熒光信號采集應該在退火延伸的整合步驟；三步法應當在72℃延伸時采集，此時絕大部分的DNA是雙鏈狀態(tài)；Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。以ABI 7500為例，選擇在哪一步采集熒光信號點亮其下面的小方塊即可。
注：市面上不同公司生產(chǎn)的熒光定量產(chǎn)品的反應程序有所不同，建議根據(jù)說明書推薦的程序進行設置，以得到蕞優(yōu)的擴增效率。
- 熔解程序
使用染料法進行熒光定量PCR時，我們通常會在擴增階段完成后進行熔解曲線分析，幫助確定產(chǎn)物類型，判斷是否有非特異性擴增的產(chǎn)生。以SYBR Green法為例，SYBR Green染料只有結合到雙鏈DNA的小溝中才能發(fā)出熒光，擴增反應完成后，對產(chǎn)物逐漸升溫同時監(jiān)測每一步的熒光信號，隨著溫度升高，DNA雙鏈解開，產(chǎn)物熒光信號下降。溫度一般設置在60℃-95℃區(qū)間，能包含產(chǎn)物Tm值和非特異產(chǎn)物Tm值即可。在某個溫度下，雙鏈DNA會解鏈一半，此后剩下的一半會迅速解鏈，熒光驟降并形成變化的拐點，這個溫度稱為退火溫度（Tm值）。將溫度與熒光強度的變化求導作圖(-dI/dT)，從而生成熔解曲線。
Tm值受產(chǎn)物長度，GC含量和離子環(huán)境等影響。因為目的產(chǎn)物長度在80-300bp，Tm值一般高于80℃，而引物二聚體比較小，大多Tm值低于75℃。而同一產(chǎn)物Tm值用不同品牌的試劑擴增時，Tm值會有所區(qū)別也是因為buffer成分的不同，如含有促解鏈的DMSO成分多，Tm值則相對低一點。
熔解曲線通常情況下可以使用儀器默認程序或者是儀器說明書上建議的程序，無需變動。
這幾個步驟設置好，可以保存、修改或者直接點擊“START RUN”進行反應。
- 結果分析
- 閾值設置（可選）
Ct值是擴增曲線和閾值線的交點對應的循環(huán)數(shù)，閾值改變Ct值也會隨之變動。但實際上，只要將閾值線設定在合適的范圍內(nèi)，任何兩個樣品間的△Ct值都會保持不變，依然可以依據(jù)△Ct值來計算不同樣本間基因表達量的倍數(shù)變化。
閾值線不能太低，否則會受到噪音信號的干擾。反之，如果設置的太高，到達擴增線性期或平臺期，數(shù)據(jù)則不準確，設置方法有兩種：
- 設為儀器默認值。點擊Analyze（分析）按鈕時，軟件會自動為我們的實驗設置好每一個Assay的蕞佳閾值線。
- 手動設置?？砂醋￠撝稻€上下拖動，需要設置在擴增曲線接近線性和線與線之間相互平行的位置，即樣本重復性*的區(qū)域，通常是在指數(shù)擴增期的中期或后期。
- 參比染料
ROX是qPCR實驗中使用的一種參比染料，用于均一化校正儀器的光程差、移液誤差或蒸發(fā)冷凝導致的體積差等，提高結果的重復性。ABI的儀器一般都需要在反應體系中添加ROX，結果分析時默認的是ROX，如果使用的Master mix里沒有添加ROX，也可以勾選NO ROX分析。但考慮到移液誤差、人為差異在qPCR實驗中的常見性，建議根據(jù)儀器型號添加相應濃度的ROX。并且，ROX還可以作為故障分析的依據(jù)，無ROX信號，可以很明確地說明沒有放置Master Mix試劑；ROX信號不規(guī)則變化，說明儀器可能存在故障。
Yeasen生物提供ROX混在Maste mix里面或不同濃度ROX單獨成管的Master mix，兼容各種類型的定量儀器。
讀到這里，你的qPCR儀器使用技能是否已解鎖？想要獲取更多干貨戳下文，下一個熒光定量高手就是你！
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