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化繁為簡！小翊帶你輕松搞定qPCR數據分析
熒光定量PCR（qPCR）是實驗室常用的一種技術，該技術可以應用于基因表達分析、基因分型、 病原體檢測、SNP分析等。 qPCR實驗操作簡單，原理易懂，但面對一堆凌亂的數據，如何進行結果分析成了頭疼的問題，今天小翊將帶你學會如何化繁為簡，輕松獲得可以發(fā)表SCI的數據！
qPCR常用的分析方法有相對定量和定量，需根據不同的實驗設計進行選擇。本期我們關注的是qPCR常見的應用—基因表達分析，一般選擇相對定量法。
1.實驗設計
假設目前需要研究光誘導對擬南芥AtSUC2基因表達的影響，以未經過任何處理的擬南芥植株作為對照組，實驗組為經過一定光誘導處理過的植株，分別提取RNA進行反轉錄，以得到的cDNA為模板，選擇擬南芥GAPDH基因作為內參，進行qPCR實驗。
需要設置的qPCR孔如下：
1）NTC用來驗證PCR體系中是否存在污染；
2）NRT是指用未經反轉錄的RNA作為模板，是對gDNA殘留的控制；
3）內參基因用來校正因樣品初始濃度不同而造成的差異；
4）而對照樣品的選擇一般有以下幾種情況：
♦ 某處理方法對基因表達的影響，將未處理的樣本作為參照樣本；
♦ 檢測基因在不同時間的表達差異，將0時刻的樣本作為參照樣本；
♦ 比較基因在不同組織中的表達差異，人為選定一個組織作為參照樣本。
這里需要注意的一點是，上面每個材料都設置了3個PCR孔（1、2、3），這是PCR重復，即技術性重復，是為了消除操作誤差，正確評估擴增效率。此外還需設置生物學重復，即不同的材料（時間、植株、批次、反應板）做的同一實驗，目的是校準生物學誤差，分析處理是否具有統(tǒng)計意義。具體到本例中，實驗組和對照組都需要至少再處理兩組擬南芥樣本（A、B、C），分別提RNA進行逆轉錄，再做qPCR，統(tǒng)計時以三個生物學重復的平均值進行分析。
2.結果分析——△△Ct法
△△Ct法的特點是只依靠Ct值來計算結果，但前提是目的基因與內參基因的擴增效率較為一致并且都在90-110%之間。具體的計算公式為：
△Ct= Ct（目的基因）- Ct（內參基因）
△△ Ct= △Ct（實驗組）- △Ct（對照組）
RQ=2^-△△Ct，RQ即為研究的目的基因在處理的樣本中相比對照組的相對表達量。
假設上面研究光誘導對擬南芥AtSUC2基因表達影響的實驗中，qPCR的結果如下：
| 實驗組(復孔Ct平均值) | 對照組(復孔Ct平均值) | ||||
A | B | C | A | B | C | |
AtSUC2 | 23.60 | 23.00 | 23.15 | 25.80 | 26.32 | 27.00 |
GAPDH | 16.75 | 16.80 | 16.72 | 16.75 | 16.50 | 16.00 |
△Ct | 6.85 | 6.20 | 6.43 | 9.05 | 9.82 | 11.00 |
2^-△Ct | 0.00867 | 0.01360 | 0.01160 | 0.00189 | 0.00111 | 0.00049 |
|
|
|
| 0.00116 | ||
2^-△△Ct | 7.47285 | 11.72617 | 9.99814 | 1.62637 | 0.95373 | 0.42093 |
Ave | 9.73238 | 1.00035 | ||||
SEM | 2.13907 | 0.60407 | ||||
計算時，首先我們把對照組的2^-△Ct數據求平均值（上圖中為0.00116），然后用2^-△Ct中的每一個數據除以這個平均值，即得到2^-△△Ct的值，后再整理得到平均值與標準差，表明實驗組目的基因表達量相比對照組提高了約9.73倍。結果用Graphpad軟件作圖如下：
利用軟件的t檢驗計算出P value=0.0024<0.05，表明具有統(tǒng)計學差異，結果可信。
3.結果分析——雙標準曲線法
在實際應用中，由于目的基因與內參基因的擴增效率常常是不同的，需要重新設計引物，優(yōu)化反應條件使得擴增效率相同，但其實我們還可以選擇更方便的雙標準曲線法。
這里我們先了解下定量的分析方法。具體的步驟是先通過PCR擴增目的片段，然后將目的片段插入克隆載體中，提取重組質粒，待測序正確后即可作為標準品。質粒DNA量可用Nanodrop等儀器測定，通過拷貝數換算公式轉換成具體的質?？截悢?/span>，然后進行倍比稀釋后擴增。以標準品拷貝數的對數值為橫坐標，以測得的Ct值為縱坐標繪制標準曲線，根據未知樣品的Ct值就可以計算出其拷貝數。
拷貝數計算公式：拷貝數=（質量÷相對分子質量）×6.02×1023。
雙標準曲線法是通過分別構建目的基因與內參基因的標準品，進行定量并制作標準曲線，計算出未知樣品拷貝數之后再進行比較，因此準確性更高。
具體的計算公式為：
Q=目的基因拷貝數/內參基因拷貝數
RQ=Q實驗/Q對照
假設上面研究光誘導對擬南芥AtSUC2基因表達影響的實驗中，分別構建AtSUC2與GAPDH的標準品，制作標準曲線如下：
待測樣品目的基因和內參基因的Ct值如下：
| 實驗組 | 對照組 | |||||
| A | B | C | A | B | C | |
AtSUC2 | Ct值 | 23.60 | 23.00 | 23.15 | 25.80 | 26.32 | 27.00 |
Copies | 2238.72 | 2884.03 | 3083.19 | 466.34 | 321.88 | 198.15 | |
GAPDH | Ct值 | 16.75 | 16.80 | 16.72 | 16.75 | 16.50 | 16.00 |
Copies | 218776.16 | 213796.21 | 223872.11 | 219785.99 | 260615.35 | 365594.79 | |
Q | 0.01023 | 0.01349 | 0.01377 | 0.00212 | 0.00124 | 0.00054 | |
|
|
|
| 0.00130 | |||
RQ | 7.87148 | 10.37664 | 10.59392 | 1.63214 | 0.95007 | 0.41692 | |
Ave | 9.61401 | 0.99971 | |||||
SEM | 1.51298 | 0.60913 | |||||
計算時，首先將目的基因與內參基因的Ct值代入標準曲線的線性關系中，獲得目的基因與內參基因分別在實驗組和對照組中的拷貝數，然后按公式Q=目的基因拷貝數/內參基因拷貝數，使得目的基因的表達量均一化。后按公式RQ=Q實驗/Q對照，計算出RQ= 9.71，表示目的基因在實驗組的表達量比對照組上升9.71倍。
結果用Graphpad軟件作圖如下：
利用軟件的t檢驗計算出P value=0.0008<0.05，表明具有統(tǒng)計學差異，結果可信。
本期的qPCR數據分析就到這里結束了，下面小翊為你推薦一波產品，讓你的實驗數據更加準確可靠，快來pick吧！
產品名稱 | 產品編號 | 規(guī)格 | 價格（元） | *（元） |
Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100 T | 1383 | 798 |
Hifair® qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox ) | 11201ES08 | 5 mL | 740 | 498 |
Hifair® qPCR SYBR® Green Master Mix (Low Rox Plus) | 11202ES08 | 5 mL | 740 | 498 |
Hifair® qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus) | 11203ES08 | 5 mL | 740 | 498 |
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，No Rox) | 11195ES08 | 5 mL | 1653 | 663 |
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，Low Rox) | 11196ES08 | 5 mL | 1653 | 663 |
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，High Rox) | 11197ES08 | 5 mL | 1653 | 663 |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，No Rox) | 11198ES08 | 5 mL | 1466 | 586 |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，Low Rox) | 11199ES08 | 5 mL | 1466 | 586 |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，High Rox) | 11200ES08 | 5 mL | 1466 | 586 |
