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NGS在病原微生物檢測中的應用
背景相關
由病原微生物引起的感染性疾病是臨床面臨的常見的疾病之一，并且隨著人群結(jié)構(gòu)變化、環(huán)境污染以及藥物濫用等因素的影響，病原體呈現(xiàn)多樣化和復雜化的趨勢，逐步威脅人類健康。 隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，NGS已逐步應用于感染性疾病的診斷、治療和監(jiān)測，在病原微生物鑒定、分型、耐藥突變檢測及新型病原體鑒定方面有其*的優(yōu)勢。
病原微生物檢測現(xiàn)狀
快速準確的診斷可以對病情進行監(jiān)控，提供有效治療，控制疾病的蔓延。目前常用的病原微生物分子檢測方法主要有：PCR技術(shù)（包括常規(guī)PCR以及qPCR），基因芯片技術(shù)，NGS測序技術(shù)。還有一些其他技術(shù)如質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）等。
方法 | 優(yōu)點 | 局限 |
PCR技術(shù) | 靈敏度與特異性高，實現(xiàn)快速鑒定 | 須有潛在的目標病原菌，從而針對性檢測 |
基因芯片 | 成本低，同時結(jié)合微機械技術(shù)，將樣本預處理核酸提取，擴增以及雜交后的檢測集成為一張芯片。 | 只能對于已知的病原體進行意向性篩查，無法檢測新的未知病原體 |
NGS | 不依賴于已的核酸序列，不需額外設計探針.針對難以培養(yǎng)甚至無法分離培養(yǎng)的菌屬有顯著優(yōu)勢。 | 拼接組裝的難點 |
質(zhì)譜技術(shù) | 有效縮短了檢測周期，且操作相對簡便。且更能檢測到活躍狀態(tài)的病原微生物 | 只能檢測已有蛋白譜的微生物 |
NGS在病原微生物檢測的中的應用
1、感染性疾病病原體的鑒定
傳統(tǒng)的檢測方法主要有涂片鏡檢，生化反應和免疫學檢測等等，但存在周期長、過程復雜以及靈敏度低等特點。PCR技術(shù)的出現(xiàn)部分解決了上述的問題，但是難以解決未知微生物檢測的難題。而NGS檢測無需對病原體進行分離培養(yǎng)，也不依賴于已知的核酸序列設計引物等，可直接對標本進行測序鑒別，大大縮減建庫時間，提高診斷效率，尤其在未知病原微生物檢測方面有的優(yōu)勢。
檢測方法 | 時長 | 特點 | 通量 |
涂片鏡檢 | 數(shù)分鐘~數(shù)小時 | 快速檢查，無法判斷，主要作為初診手段。 | 低通量，單次檢測一種/類微生物 |
生化反應 | 數(shù)小時~數(shù)天 | 針對特定微生物檢測 | |
免疫學檢測 | |||
NGS | 1-3天 | 時間短，所有病原體一次檢出 | 高通量，單次檢出所有微生物 |
目前NGS在病原微生物鑒定方面主要有兩種形式：rRNA多樣性測序和全基因組測序，前者偏向細菌、真菌的鑒定以及菌群分析，后者獲取的信息更為全面，一般偏重病毒鑒定。
2、病原體耐藥及毒力特征檢測
在當前的抗生素不規(guī)范使用以及宿主免疫等重重壓力下，病原體勢必在毒性以及耐藥方面有進化。這種高毒性的以及高耐藥性的菌株往往是導致感染性疾病發(fā)病率、死亡率居高不下的重要原因。
臨床上耐藥性及毒性檢測方法主要是體外藥物敏感性試驗、耐藥菌表型檢測等方法。這些方法操作繁瑣，且較費時、費力。NGS技術(shù)通量高、快速，在一次測序反應中即可獲得細菌整個基因組的耐藥、毒力等相關基因信息，有助于揭示病原體毒力及耐藥機制，對臨床治療及指導用藥均具有重要意義。
3、病原體分型及流行溯源
目前病原體分型方法主要有多位點序列分型、脈沖場凝膠電泳、多位點串聯(lián)重復序列分析技術(shù)等。這些技術(shù)可檢測病原體的型別，但分辨率較低，對于相似或變異度*的病原體如病毒等則難以區(qū)別。而 NGS則彌補了此項缺陷，通過檢測病原體全基因組序列，獲得全部遺傳信息，被認為是分辨率zui高的病原體分型方法。
病原體分型技術(shù) | 優(yōu)勢 | 局限性 |
多位點序列分型（MLST） | 操作簡單，應用方便，可重復性強，易實現(xiàn)標準化，不同實驗室結(jié)果可比性高 | 分辨力較低，價格高昂 |
脈沖場凝膠電泳（PFGE） | 分辨率較高，可重復性強 | 操作繁瑣，周期較長，設備昂貴，實驗室間可比性較差 |
多位點串聯(lián)重復序列分析（MLVA） | 分辨力較高，成本低，操作簡易 | 引物設計繁瑣，實驗室間可比性較差實驗室間可比性較差，計算結(jié)果準確性不高 |
NGS（主要是WGS） | 分辨力* | 工作量大，周期長，價格高昂 |
近年來抗生素的不規(guī)范使用甚至濫用，使細菌耐藥情況日益突出，耐藥菌株在醫(yī)院內(nèi)的暴發(fā)時有發(fā)生。NGS技術(shù)在對耐藥菌等病原體進行分型的基礎上，可以判斷同源性遠近，分辨不同的進化路線，成為追蹤病原體*的重要手段。
4. 腸道微生物菌群宏基因組測序分析
宏基因組學（Metagenomics）：以微生物生態(tài)群落中所有微生物的基因組為研究對象，通過直接從環(huán)境樣本中提取全部微生物的DNA或者RNA構(gòu)建宏基因組文庫，研究群落中物種組成和功能組成、同一個群體內(nèi)不同微生物的相互作用、微生物群落與宿主之間的相互作用，并進行不同表型的樣品比較分析，來解釋生物學現(xiàn)象。
圖來源于Fields，Science. 2001,291,5507:1221-1224
近年來腸道微生物相關研究愈趨火熱，不少研究表明，腸道菌群與宿主共生共進化，在營養(yǎng)代謝等方面影響人體健康，腸道微生態(tài)失衡與人體諸多疾病存在密切關系。腸道微生物中關鍵功能菌更是有可能成為疾病診治的新型生物標志物和治療靶點。2015年《科學》雜志還發(fā)文呼吁發(fā)起“聯(lián)合微生物組計劃”。而NGS測序有望憑借其數(shù)據(jù)通量高、成本低、速度快的特點，成為研究腸道微生物和宏基因組學的有力工具。
NGS在應用中面臨的主要挑戰(zhàn)
雖然NGS在病原微生物的檢測中有著明顯的優(yōu)勢，但是也依然面臨不少挑戰(zhàn)：
- 參考數(shù)據(jù)庫的完整性
微生物檢測鑒定的準確性很大程度上取決于參考數(shù)據(jù)庫的范圍與完整性；
- 臨床標本的復雜性
臨床標本來源復雜多樣，可能存在病原體信息太少而導致數(shù)據(jù)丟失或病原體數(shù)據(jù)混雜在正常菌群中難以區(qū)分;
- NGS測序技術(shù)的局限性
目前的分析質(zhì)量依賴于測序質(zhì)量、基因組組裝的質(zhì)量以及參考基因組序列的選擇和質(zhì)量；
- 質(zhì)量控制和標準化
參考基因組的選擇，分型方法如何選擇等，目前尚未建立不同標本測序前處理和參數(shù)設置的統(tǒng)一標準。
文末小結(jié)：
NGS技術(shù)被認為是一種應用前景的實驗技術(shù)，盡管依然路途艱辛，但隨著測序成本的降低以及測序技術(shù)的進步，相比較于其他的檢測方法，NGS在病原微生物檢測行業(yè)的優(yōu)勢逐漸凸顯，必將成為臨床診斷的有力工具。目前國內(nèi)的基因檢測市場空間巨大，臨床醫(yī)師也越來越認識到這項技術(shù)的價值，加上目前初始階段的從業(yè)者們在參考數(shù)據(jù)庫構(gòu)建等方面的持續(xù)耕耘，病原微生物基因檢測市場有更廣闊的空間亟待發(fā)掘。
明星產(chǎn)品推薦：
OnePot系列DNA建庫試劑盒是針對illumina平臺定向研發(fā)的酶切法建庫試劑盒，擺脫了繁瑣的超聲流程，采用酶切法建庫。精簡實驗流程，建庫更快，成本更低，且兼容自動化建庫平臺，是病原微生物檢測的“助手”。
主要特點：
- 實驗流程更精簡：片段化/末修/加A一步完成，大大縮減建庫時間；
- 樣本適用范圍廣：適用于痰液，腹水，腦脊液，F(xiàn)FPE等各類樣本；
- 適用場景更廣泛：自動化建庫平臺首xuan；
- 酶切可控時間長：僅需調(diào)整酶切時間即可得到目標片段；
- 耐抑制物能力強：對于復雜樣本中的一些抑制物有更好的耐受能力。
微生物實戰(zhàn)案例：
客戶單位：數(shù)據(jù)來源于上海某生物公司D*
實驗樣本：痰液，腹水
實驗結(jié)論：不同模板的質(zhì)量不均一，采用不同的酶切時間可獲得文庫。
產(chǎn)品信息：
類型 | 名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
建庫試劑盒 | Hieff NGS® OnePotⅡ DNA Library Prep Kit for Illumina® | 12204ES08 | 8 T |
12204ES24 | 24 T | ||
12204ES96 | 96 T |
參考文獻：
1.分子技術(shù)在感染性疾病病原體溯源和監(jiān)測中的應用與展望, 中華醫(yī)學檢驗雜志. 2018，41（1）：1-4
2.新一代測序技術(shù)在臨床微生物檢測中的應用, 診斷學理論與實踐. 2018，2：127-131
3.宏基因組測序在感染性疾病病原體檢測中的應用, 傳染病信息. 2018，1（31）：15-18
4.感染性疾病病原學診斷新技術(shù)與臨床應用策略, 協(xié)和醫(yī)學雜志. 2018，9（5）：399-403
