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關(guān)于新冠病毒RT-PCR核酸檢測(cè)假陰性結(jié)果的思考

在新冠肺炎防治工作開(kāi)展過(guò)程中，隨著對(duì)發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)、臨床體征、診斷技術(shù)等方面認(rèn)識(shí)逐步清晰，病人的診治方案也逐步完善。近期，非常多的討論集中在新冠病毒核酸檢測(cè)方法出現(xiàn)漏檢和假陰性的問(wèn)題上面。

1. 在全國(guó)其他省份新增確診人數(shù)連續(xù)下降的背景下，自2月12日起連續(xù)兩天的湖北省衛(wèi)健委發(fā)布的通報(bào)中，分別提到“當(dāng)日新增臨床診斷病例4890例，現(xiàn)有臨床診斷病例10567例”和“新增新冠肺炎病例14840例(含臨床診斷病例13332例)”。《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》在湖北省的病例診斷分類中增加了“臨床診斷”。根據(jù)該方案，湖北省將臨床診斷病例數(shù)納入確診病例數(shù)進(jìn)行公布。臨床診斷病例指具有肺炎影像學(xué)特征的疑似病例，但確診病例診斷標(biāo)準(zhǔn)不變。

2. 1月12日，李文亮醫(yī)生因發(fā)燒、咳嗽在武漢中心醫(yī)院接受隔離治療。2月1日，他發(fā)布微博“今天核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，塵埃落定，終于確診了”?；仡櫪钗牧劣⑿鄄∏榇_診進(jìn)展：共查了3次核酸檢測(cè)，第—次結(jié)果未知，第二次陰性，第三次陽(yáng)性，用了20天。2月6號(hào)，南方周末報(bào)道杭州一所醫(yī)院病例測(cè)了6次核酸試劑都為陰性，直到第7次才測(cè)出陽(yáng)性。

3. 重慶市人民醫(yī)院三院院區(qū)檢驗(yàn)科對(duì)6種國(guó)產(chǎn)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑檢測(cè)性能進(jìn)行了比較與分析，得出結(jié)論對(duì)弱陽(yáng)性樣品的檢測(cè)能力有差異，部分試劑的準(zhǔn)確性、靈敏度及重復(fù)性欠佳，亟需進(jìn)一步優(yōu)化，提高其性能，以便更好地適應(yīng)大規(guī)模的篩查需求。對(duì)診斷試劑性能及其穩(wěn)定性提出疑問(wèn)。

4. 2月5日，危重癥醫(yī)學(xué)專家、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院院長(zhǎng)王辰院士接受央視采訪時(shí)表示，“對(duì)于真是這個(gè)病的病人，也不過(guò)只有30%-50%的陽(yáng)性率。通過(guò)（采集疑似病患）咽拭子的辦法，還是有很多假陰性的。核酸沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，但是實(shí)際上是的。”

一、為何選擇核酸檢測(cè)作為確診感染的金標(biāo)準(zhǔn)呢？

核酸作為生物的遺傳物質(zhì)，由A、T、C、G四種堿基按照不同的順序排列組成。堿基排列順序的相似性決定了物種之間的保守性，具有相似性的堿基序列為物種間的保守序列。堿基排列順序的不同決定了物種之間的特異性，這些特異性的區(qū)域有別于其他物種，具有物種的代表性。新型冠狀病毒的遺傳物質(zhì)是RNA，由3.3萬(wàn)個(gè)左右的堿基組成。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR是通過(guò)引物和探針與新冠病毒核酸特異性的RNA區(qū)域高度匹配，一旦檢測(cè)到，即可判斷為“陽(yáng)性”；高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)新冠狀病毒核酸序列進(jìn)行完整測(cè)序并全序列比對(duì)分析，與已知新型冠狀病毒高度相似的，即可判斷為“陽(yáng)性”。因此，從方法學(xué)上來(lái)看，核酸檢測(cè)技術(shù)是直接本質(zhì)的病原學(xué)證據(jù)，優(yōu)于其他臨床表現(xiàn)、臨床體征及CT檢測(cè)等經(jīng)驗(yàn)判讀。這就是我們說(shuō)病毒核酸檢測(cè)是確診感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”。相較于高通量測(cè)序技術(shù)，RT-PCR診斷耗時(shí)短，檢測(cè)樣本多，結(jié)果判定簡(jiǎn)單快速，檢測(cè)成本低，特別適合本次大面積流行的新冠肺炎疫情。

圖1. 新型冠狀病毒與SARS冠狀病毒ORF1b-nsp14相似性與特異性：·代表相同堿基。

二、假陰性概念及造成假陰性的原因

上面新冠病毒核酸檢測(cè)方法出現(xiàn)漏檢和假陰性的報(bào)道不再是關(guān)注出結(jié)果的速度，更側(cè)重于核酸檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。所謂漏檢和假陰性指的是一個(gè)新冠肺炎患者應(yīng)該被確診為陽(yáng)性，但RT-PCR未檢測(cè)到新型冠狀病毒RNA。漏檢和假陰性會(huì)帶來(lái)的社會(huì)恐慌及對(duì)病情醫(yī)治的控制不及時(shí)的影響可想而知。

由上面圖片可以看出，產(chǎn)生假陰性的原因，可能包括：

1. 方法學(xué)：因bing毒變異，引物和探針不能識(shí)別變異后的序列。

2. 樣本采集與保存環(huán)節(jié)：采樣部位不含病毒或病毒含量較低，不能真實(shí)反映疾病情況。這涉及到對(duì)病毒的致病機(jī)理及疾病進(jìn)程的認(rèn)識(shí)。樣品保存不當(dāng)，造成病毒核酸降解。

3. 核酸提取環(huán)節(jié)：提取核酸質(zhì)量差，或提取效率低，病毒核酸有損失。

4. 基因擴(kuò)增環(huán)節(jié)：試劑檢測(cè)下限不夠，或試劑性能穩(wěn)定性欠佳；或儀器設(shè)備的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

5. 人為因素：實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)。

一句話概括，要避免假陰性的產(chǎn)生，需要全行業(yè)全流程的專業(yè)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和體系建設(shè)來(lái)保證RT-PCR檢測(cè)的穩(wěn)定性。

三、如何應(yīng)對(duì)假陰性

從規(guī)避RT-PCR假陰性問(wèn)題上，我們需要：

A. 制備達(dá)到一定數(shù)量的病毒RNA

要求采樣部位含有病毒并且病毒含量要達(dá)到檢測(cè)的試劑下限。病毒含量在病程早晚期階段以及機(jī)體不同部位有所不同（這與病毒入侵機(jī)制有關(guān)），剛感染機(jī)體時(shí)，病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制少，整體含量均低。在應(yīng)對(duì)未知疫情時(shí)，對(duì)于感染機(jī)制、病癥等缺乏了解時(shí)，取樣部位的選擇更加受限。目前了解到，新冠病毒檢出的取樣部位的難易程度為肺泡灌洗液，深咳痰，鼻咽部，口咽部，血液，糞便。通過(guò)對(duì)疑似病人多個(gè)部位同時(shí)采樣或同一部位反復(fù)檢測(cè)來(lái)增加采集到病毒RNA的幾率。

樣本中病毒RNA需經(jīng)過(guò)提取，以實(shí)現(xiàn)病毒的有效富集及純化。提取要求可以短期內(nèi)充分裂解釋放樣本中的核酸，并大限度的回收高純度病毒核酸。RNA易被環(huán)境中（操作環(huán)境及操作人）或醫(yī)療樣本內(nèi)源性的RNase降解，提取過(guò)程中要特別注意。推崇自動(dòng)化操作，減少人為因素帶來(lái)的偏差。

B. 與病毒RNA匹配的引物與探針

病毒傳染人群的目的在于存活，在流行一段時(shí)間后會(huì)發(fā)生變異，以保證它的傳染性。病毒的變異表現(xiàn)是在它核酸序列突變后，即堿基序列發(fā)生變化。用于RT-PCR病毒核酸檢測(cè)的引物與探針是否會(huì)適用于變異后的病毒這是個(gè)變量。目前，新型冠狀病毒的變異能力R₀為3.77人。因此，針對(duì)病毒核酸多個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)匹配引物和探針很重要，監(jiān)控病毒一代傳染，二代傳染人群數(shù)量，實(shí)時(shí)引入高通量測(cè)序手段對(duì)病毒核酸進(jìn)行分析也很重要。

另外，據(jù)圈內(nèi)從事Oligo合成的大佬所說(shuō)，引物與探針的質(zhì)量對(duì)于RT-PCR表現(xiàn)也至關(guān)重要。

C. 高效擴(kuò)增病毒RNA

相較于CT影像學(xué)、臨床體征等臨床表現(xiàn)，在保證前端取樣、核酸提取情況下，RT-PCR更靈敏。它實(shí)現(xiàn)了病毒分子體外一變二，二變四成指數(shù)倍的積累放大，可以幫助疾病的早發(fā)現(xiàn)，早治療。目前新冠qPCR檢測(cè)試劑盒的低檢出限一般是200-1000 cp/mL。另一個(gè)要考慮的是檢測(cè)試劑盒低檢出限的穩(wěn)定性。上游酶原料和輔料的生產(chǎn)工藝對(duì)于qPCR檢測(cè)下限和穩(wěn)定性至關(guān)重要。

后，針對(duì)疾病的診斷不應(yīng)只依靠于分子檢測(cè)，應(yīng)結(jié)合RT-PCR檢測(cè)結(jié)果、病人的癥狀等綜合診斷疾病。不過(guò)，建議在資源允許，即使是散發(fā)性的疑似病例也需經(jīng)病原學(xué)技術(shù)確診。

就RT-PCR作為分子診斷手段的假陰性問(wèn)題，我們還應(yīng)更細(xì)致地結(jié)合本次疫情深入思考：如何更精準(zhǔn)地保證樣品采集與保存、核酸分離純化及核酸擴(kuò)增等各環(huán)節(jié)的穩(wěn)定性與精準(zhǔn)性。

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