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文獻(xiàn)分享|基于轉(zhuǎn)座酶的RNA-seq快速建庫(kù)流程，助力COVID-19檢測(cè)新思路

文獻(xiàn)精讀

文獻(xiàn)題目：RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids

中文題目：直接作用于切割RNA/DNA雜合鏈的RNA測(cè)序方法

發(fā)表時(shí)間：2020.1.27

發(fā)表期刊：PNAS

影響因子：9.58

合作單位：北京大學(xué)、清華大學(xué)

關(guān)鍵詞：RNA-Seq、Tn5轉(zhuǎn)座酶、SHERRY、ScRNA、SMART-Seq

背景簡(jiǎn)介

RNA測(cè)序（RNA-seq）在基因表達(dá)差異分析方面的應(yīng)用來(lái)說(shuō)頗為成熟，主要包括目標(biāo)RNA富集及片段化、一鏈和二鏈cDNA合成、PCR擴(kuò)增等幾個(gè)主要流程。其中二鏈cDNA的合成是獲得高質(zhì)量文庫(kù)的關(guān)鍵，但二鏈cDNA的合成需要引入額外的DNA聚合酶，可能導(dǎo)致測(cè)序的偏好性增加。

近日，北京大學(xué)的黃巖誼和謝曉亮研究團(tuán)隊(duì)聯(lián)合清華大學(xué)王建斌研究團(tuán)隊(duì)在美國(guó)《國(guó)家科學(xué)院院刊》(PNAS)發(fā)表了一篇名為“RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids”，介紹了一種新的基于Tn5轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序快速建庫(kù)方法，不僅可以消除常規(guī)RNA-seq需要cDNA二鏈合成的繁瑣性而且極大的突破了Tn5僅在DNA上作用的限制，大大拓展了Tn5轉(zhuǎn)座酶的應(yīng)用范圍，同時(shí)或?qū)闋縿?dòng)人心的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）檢測(cè)提供新思路。

文章方法及主要內(nèi)容

1.樣本處理：

1）Tn5轉(zhuǎn)座酶和Tn5 D188E突變株的制備、純化。

2）HEK293T和HeLa細(xì)胞培養(yǎng)、總RNA提取和純化mRNA。

3）單細(xì)胞制備。

2.研究?jī)?nèi)容：

1）Tn5轉(zhuǎn)座酶通過(guò)作用于RNA/cDNA雜合鏈用于RNA-seq

Tn5、RNase H和 MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)比對(duì)和分子對(duì)接的結(jié)果表明Tn5能夠作用于RNA/DNA雜交雙鏈。隨后將Tn5應(yīng)用在HEK293T提取的mRNA/cDNA雜合鏈上，并進(jìn)一步PCR擴(kuò)增，片段化的RNA/cDNA雜合鏈和擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分布顯示，擴(kuò)增后的產(chǎn)物分布比片段化的產(chǎn)物長(zhǎng)100-150 bp左右。因此Tn5可作用于RNA/DNA雜合雙鏈同時(shí)應(yīng)用于RNA-Seq快速建庫(kù)方法。

圖1.Tn5轉(zhuǎn)座酶在RNA/DNA雜合鏈的作用

2）SHERRY應(yīng)用于一步快速RNA-seq文庫(kù)制備

Tn5轉(zhuǎn)座酶作用于RNA/DNA雜合鏈的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序快速建庫(kù)方法，作者起名為SHERRY（Sequencing HEteRo RNA-DNA-Hybrid），SHERRY法轉(zhuǎn)錄組快速建庫(kù)流程：不同種類的RNA經(jīng)過(guò)oligo-dT引物的反轉(zhuǎn)錄后，Tn5轉(zhuǎn)座酶隨機(jī)結(jié)合在RNA/DNA雜合鏈上進(jìn)行切割；在Tagmentation之后，轉(zhuǎn)座酶會(huì)在雜合鏈兩端加上adaptor接頭，隨后進(jìn)行延伸反應(yīng)得到完整的含接頭的雙鏈DNA，后在測(cè)序引物作用下進(jìn)行之后的PCR文庫(kù)擴(kuò)增。

圖2.SHERRY轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)路線

SHERRY法轉(zhuǎn)錄組快速建庫(kù)流程和常規(guī)RNA-seq法在10 ng和200 ng的起始RNA上進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示起始量為10 ng的RNA，SHERRY法檢測(cè)結(jié)果更精確。在差異表達(dá)基因檢測(cè)能力方面，SHERRY法和常規(guī)RNA-seq法檢測(cè)差異基因數(shù)目和fold changes數(shù)較為一致。同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)scSHERRY法在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中表現(xiàn)為更高的測(cè)序質(zhì)量和更低的偏好性。

圖3.SHERRY法在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的應(yīng)用

文章亮點(diǎn)

亮點(diǎn)1：Tn5轉(zhuǎn)座酶識(shí)別RNA/DNA雜交雙鏈并一步完成片段化和加接頭反應(yīng)，突破了在雙鏈DNA上應(yīng)用的限制；

亮點(diǎn)2：基于SHERRY的RNA-seq整體包含三個(gè)流程：RNA逆轉(zhuǎn)錄、RNA/cDNA的片段化和PCR擴(kuò)增，簡(jiǎn)化了常規(guī)RNA-Seq建庫(kù)流程，總體耗時(shí)僅約4小時(shí)，手動(dòng)操作時(shí)間少于30分鐘，同時(shí)可在一個(gè)管子中完成反應(yīng)。實(shí)現(xiàn)RNA的快速建庫(kù)，也極大的保證了測(cè)序的真實(shí)性。

亮點(diǎn)3：測(cè)序成本方面，SHERRY法轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)僅為常規(guī)RNA-seq法的五分之一，大大節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。

總結(jié)

基于Tn5轉(zhuǎn)座酶直接作用于RNA/DNA雜合鏈的片段化原理開(kāi)發(fā)了一種轉(zhuǎn)錄組測(cè)序快速建庫(kù)新方法-SHERRY，進(jìn)一步拓展了Tn5轉(zhuǎn)座酶的新用途，不僅解決了常規(guī)RNA-seq過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)和偏好性大的問(wèn)題，同時(shí)成本方面也大大降低。因此，相較于傳統(tǒng)的RNA文庫(kù)制備方法，SHERRY法快速建庫(kù)有著更大的競(jìng)爭(zhēng)力。當(dāng)前常規(guī)RNA-seq在SARS-CoV-2的鑒定、分型、溯源、診斷等方面展現(xiàn)了重要作用，但仍基于傳統(tǒng)的病原微生物宏基因組測(cè)序方法，耗時(shí)長(zhǎng)且過(guò)程繁瑣。而基于Tn5轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序快速建庫(kù)方法或?qū)镃OVID-19快速、精準(zhǔn)檢測(cè)帶來(lái)新的曙光。

參考文獻(xiàn)：Lin Di, Yusi Fu, Yue Sun, Jie Li, Lu Liu, Jiacheng Yao, Guanbo Wang, Yalei Wu, Kaiqin Lao, Raymond W. Lee, Genhua Zheng, Jun Xu,  View ORCID ProfileJuntaek Oh,  View ORCID ProfileDong Wang, X. Sunney Xie, Yanyi Huang, and  View ORCID ProfileJianbin Wang，RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids（2020）. PNAS,117(6):2886-2893.

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