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從武漢肺炎爆發(fā)以來，翊圣生物積極參與其中，基于長期儲備的分子酶雙向改造、蛋白發(fā)酵純化和高效抗體篩選技術(shù)平臺，翊圣生物已儲備有2000多萬份新型冠狀病毒檢測試劑盒酶原料，可日組裝40萬次新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒！現(xiàn)在我們總結(jié)武漢肺炎診斷試劑盒（RT-PCR法）中的核心原料的開發(fā)策略，供讀者參閱。
一、開發(fā)目的：
利用中國CDC和WHO指導(dǎo)文件中相關(guān)基因的引物和探針，依次驗(yàn)證質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、假病毒標(biāo)準(zhǔn)品，篩選出適合新冠病毒的RNA擴(kuò)增試劑。
二、開發(fā)策略：
1. 模擬測試質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品樣本
將檢測靈敏度和特異性作為RT-PCR探針法檢測試劑的核心指標(biāo)，篩選出了靈敏度至少達(dá)到10 copies (20 μL反應(yīng)體系)，高特異性判別新冠病毒ORF1ab、N gene和E gene的候選配方。
圖1. 以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene質(zhì)粒為模板，模板投入量107-101拷貝數(shù)，采用CDC建議引物和探針，進(jìn)行單管多重?cái)U(kuò)增檢測。在此過程中，根據(jù)引物和探針屬性，優(yōu)化擴(kuò)增程序
圖2. 以SARS-CoV-2 ORF1ab質(zhì)粒，E gene PCR產(chǎn)物為模板，模板投入量107-101拷貝數(shù)，采用WHO建議引物和探針，進(jìn)行單管多重?cái)U(kuò)增檢測。在此過程中，根據(jù)引物和探針屬性，優(yōu)化擴(kuò)增程序。
2. 模擬測試假病毒標(biāo)準(zhǔn)品樣本
模擬新冠病毒樣本核酸提取到擴(kuò)增全流程，篩選出了假病毒樣本靈敏度至少達(dá)到103 copies/mL (25 μL反應(yīng)體系)的配方。
圖3. 以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene假病毒為模板，模板投入量107-103 copies/mL，采用中國CDC建議引物和探針，進(jìn)行單管多重?cái)U(kuò)增檢測。
3. 試劑穩(wěn)定性測試
將試劑保存條件的容忍度和批次穩(wěn)定性作為試劑穩(wěn)定性的評估指標(biāo)，測定該配方批次間和批次內(nèi)CV值＜5%，可反復(fù)凍融次數(shù)50次，4℃，25℃保存一周，性能無變化，保證了質(zhì)量穩(wěn)定可靠。
圖4. 生產(chǎn)批次：H1029950。以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene假病毒為模板，模板投入量107-103 copies/mL，進(jìn)行單管多重?cái)U(kuò)增檢測，比較Ct值和擴(kuò)增曲線線型。
圖5. 生產(chǎn)批次：H1029950、H1029920、H1025890。以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene假病毒為模板，模板投入量107-103 copies/mL，進(jìn)行單管多重?cái)U(kuò)增檢測，比較Ct值和擴(kuò)增曲線線型。
圖6. 以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene假病毒為模板，模板投入量106-103 copies/mL，進(jìn)行單管多重?cái)U(kuò)增檢測，比較4℃、25℃保存1-7天后Ct值和擴(kuò)增曲線線型。
圖7. 以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene假病毒為模板，模板投入量106-103 copies/mL，進(jìn)行單管多重?cái)U(kuò)增檢測，比較反復(fù)凍融50次處理后Ct值和擴(kuò)增曲線線型。
三、RT-PCR檢測試劑盒：Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit
至此，即開發(fā)出基于多重?zé)晒釸T-PCR原理，可以以冠狀病毒RNA為模板進(jìn)行多重定量PCR反應(yīng)的定量試劑，并作為新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的核心組分，用于試劑盒組裝。
產(chǎn)品信息
| 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
| Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit | 13110ES60 | 100 T |
| Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit | 13110ES80 | 1000 T |
| Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit | 13110ES92 | 10000 T |
搭配UDGase/dUTP，可預(yù)防氣溶膠污染，產(chǎn)品如下：
| 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
| Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG plus) | 13111ES60 | 100 T |
| Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG plus) | 13111ES80 | 1000 T |
| Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG plus) | 13111ES92 | 10000 T |
HB200225
