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你是否正在驗證miRNA與lncRNA的作用機制？
是否在分析確認miRNA的靶基因？
在研究轉(zhuǎn)錄因子和啟動子的實驗中，你是否想確定結(jié)合位點的序列？
這些問題都可以用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)來嘗試解決。
雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)介紹
基于熒光素酶（luciferase）的發(fā)光原理，科學家發(fā)明了雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase）。兩者可催化各自的底物發(fā)生氧化作用產(chǎn)生生物熒光，產(chǎn)生的熒光數(shù)值大小即表示了兩種酶的表達量多少。
圖1. Luciferase發(fā)光原理
Firefly luciferase和Renilla luciferase之所以被稱為報告基因，是因為在基因表達調(diào)控研究時，利用兩者表達產(chǎn)生的熒光比值可以監(jiān)控、證實微觀層面上的分子間的相互作用。具體做法是：將靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5’啟動子區(qū)克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR區(qū)或lncRNA結(jié)合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游，以研究啟動子的強弱和轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的作用或miRNA對目的基因或lncRNA的調(diào)控作用（見圖2）。與此同時，引入包含Renilla luciferase基因的TK載體作為內(nèi)參，以便消除細胞轉(zhuǎn)染等因素帶來的組間誤差。
圖2.報告基因系統(tǒng)用于基因表達調(diào)控研究
雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)中的luciferase來源于細菌、螢火蟲、發(fā)光海洋生物等，可以在哺乳細胞中直接表達，無需表達后修飾，直接具備*酶活性。與綠色熒光蛋白（GFP）不同，它們的發(fā)光檢測不需要激發(fā)光激發(fā)，且發(fā)光穿透力更強，這使其具備可定量、高靈敏度及低背景等特點。
雙熒光素酶報告基因檢測的應用
下面從實驗方案設(shè)計、實驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析幾個方面介紹幾個案例，供大家參考。
1、利用雙報告基因檢測系統(tǒng)研究miRNA與3’UTR的相互作用
實驗目的：驗證大鼠miR-1與靶基因ATG13 3’UTR是否發(fā)生作用，并進一步確定miR-1與ATG13 3’UTR的作用位點。
實驗方案：構(gòu)建luc-3’-UTR-WT載體和luc-3’-UTR-mut載體，將其與海腎載體及miRNA mimics共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染24-48h后使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)（翊圣產(chǎn)品貨號：11402ES）檢測。
實驗分組：
a | Luc-NC + mimics-NC |
b | Luc-NC + mimics-miR-1 |
c | Luc-3’UTR-WT + mimics-NC |
d | Luc-3’UTR-WT + mimics-miR-1 |
e | Luc-3’UTR-mut + mimics-NC |
f | Luc-3’UTR-mut + mimics-miR-1 |
實驗結(jié)果：
實驗分組 | Luc值（均值） | Ren值（均值） | Ratio (均值) |
Luc-NC + mimics-NC | 185214 | 32007 | 5.798 |
Luc-NC + mimics-miR-1 | 174577 | 30016 | 5.854 |
Luc-3’UTR-WT + mimics-NC | 186580 | 32249 | 5.820 |
Luc-3’UTR-WT + mimics-miR-1 | 35773 | 30233 | 1.202 |
Luc-3’UTR-mut + mimics-NC | 186556 | 32489 | 5.757 |
Luc-3’UTR-mut + mimics-miR-1 | 188393 | 32550 | 5.821 |
圖3. miR-1與3’UTR相互作用的分析（***表示p<0.001）
實驗結(jié)論：
ATG13 3’UTR為miR-1靶序列。
- 利用雙報告基因檢測系統(tǒng)研究轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的相互作用
實驗目的：驗證轉(zhuǎn)錄因子IRF3對IFN-β啟動子的調(diào)控作用。
實驗方案：構(gòu)建Luc-IFN-β啟動子載體和IRF3的過表達載體。共轉(zhuǎn)染后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)（翊圣產(chǎn)品貨號：11402ES）檢測分析熒光值差異。
實驗分組：對照組為Luc-IFN-β和pTK-RL，實驗組為Luc-IFN-β、pTK-RL和IRF3的過表達載體共轉(zhuǎn)染。
實驗結(jié)果：
實驗分組 | Luc值（均值） | Ren值（均值） | Ratio (均值) |
對照組 | 69576 | 456979 | 0.15 |
實驗組 | 462790 | 16248 | 28.48 |
圖4. IRF3對IFN-β啟動子的調(diào)控
實驗結(jié)論：轉(zhuǎn)錄因子IRF3對IFN-β啟動子起正調(diào)控作用。
影響雙熒光素酶報告基因檢測的因素
作為報告基因檢測試劑研發(fā)的廠家，我們?yōu)榇蠹铱偨Y(jié)了獲取好數(shù)據(jù)的方法，避免大家掉坑：
坑1：檢測數(shù)值太低
正常表達水平下，熒光值的數(shù)量級應在104-107數(shù)量級左右，導致數(shù)值低主要有以下幾個原因：啟動子活性、轉(zhuǎn)染效率低、裂解不充分、底物失效、操作不規(guī)范等原因，具體的原因需要實驗者進行排查。相應的解決方案如下表：
實驗問題 | 解決方案 |
轉(zhuǎn)染效率低 | 1、確保細胞狀態(tài)是良好的，通常選擇指數(shù)分裂期的細胞進行轉(zhuǎn)染； 2、可以選擇過表達的熒光蛋白質(zhì)粒作為陽性對照； 3、轉(zhuǎn)染試劑的選擇也至關(guān)重要，比如在做miRNA研究的實驗中，如果Lipo2000或Lipo3000的轉(zhuǎn)染效率不能滿足的話，可以選擇更換其它轉(zhuǎn)染試劑。 |
裂解不充分
| 1、細胞培養(yǎng)時間不宜過長，不超過36h，培養(yǎng)時間過長的話，細胞難裂解 2、裂解液的量要足以充分裂解細胞 3、實驗對象為煙草葉片時，可在EP管中加入液氮和預冷的小鋼珠對葉片進行研磨，使裂解更充分 |
底物失效
| 1、底物保存的時候要避光低溫保存，尤其是腔腸素，推薦-80℃保存。 2、反應工作液建議現(xiàn)配現(xiàn)用。 |
操作不當 | 熒光素酶的半衰期一般約30min，加完底物后可立即檢測，盡量在30min內(nèi)完成。 |
坑2. 復孔差異大
雙報告基因檢測系統(tǒng)較為靈敏，檢測結(jié)果受多種因素的影響，因此，一般設(shè)置3個或3個以上的復孔，復孔之間有差異是正常的，差異在同一個數(shù)量級可以接受。想要得到更準確的實驗結(jié)果，需盡量減少復孔的差異性，建議如下：1、裂解后建議離心取上清，保證樣本均一性；2、保證加樣的準確性；3、樣品和底物混合后到檢測前的時間以及檢測時間應控制在相同的時間內(nèi)。
以上的實驗方案和建議是否對您有幫助呢？如有不解歡迎咨詢小翊。祝大家實驗順利~
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