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溶瘤病毒治療，盡管具有針對腫瘤細胞的選擇性復制和殺傷能力，但其療效受到一些限制。這些局限性包括系統(tǒng)給藥時，病毒在腫瘤組織中的吸收不足，以及病毒可能導致免疫檢查點蛋白過度表達，從而抑制免疫系統(tǒng)的反應。腫瘤微環(huán)境對治療效果的影響也是一個關鍵因素。在微環(huán)境中，免疫檢查點蛋白如PD-L1的過表達可以降低免疫反應，進而減少治療效果。
為了應對這些挑戰(zhàn)，基因編輯技術，特別是CRISPR/Cas9，被提出用于破壞腫瘤細胞中的免疫檢查點基因。這種策略有望逆轉腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，從而提高治療效果。
然而，腫瘤靶向給藥仍然面臨挑戰(zhàn)，例如需要開發(fā)更有效的載體系統(tǒng)，以確保藥物能夠準確地送達腫瘤部位。一種有前景的策略是將溶瘤病毒負載在具有腫瘤趨向性的免疫細胞表面，以實現(xiàn)病毒和細胞的同步給藥，這有望提高治療效果。此外，開發(fā)溶瘤病毒基因編輯治療策略，可以克服當前溶瘤病毒治療存在的局限性，為腫瘤治療提供新的解決方案。為此，浙江大學藥學院平淵團隊開發(fā)了一種名為ONCOTECH的新型治療方法，該方法作為一種結合病毒治療和細胞治療的技術，展現(xiàn)了良好的臨床轉化潛力。該研究于2024年2月9日在線發(fā)表于Nature Biotechnology期刊(IF:46.9)，論文標題為“An oncolytic virus–T cell chimera for cancer immunotherapy"。
在這項創(chuàng)新性的研究中，研究團隊采取了一種方法，將腫瘤溶解病毒（具體來說是腫瘤溶解腺病毒，簡稱為OAs）與T細胞相結合，以期提升對癌癥的治療效率。具體來說，該方法(ONCOTECH)利用了一種攜帶Cas9基因和靶向PDL1 sgRNA的eOA病毒，通過精準的基因編輯技術，下調腫瘤細胞中PDL1的表達，從而增強溶瘤病毒的療效。
此外，將eOA病毒裝載到T細胞表面，形成了一個復合體，實現(xiàn)了eOA病毒和T細胞的同步靶向給藥，這不僅增強了T細胞的治療效能，還改善了腫瘤免疫抑制微環(huán)境。ONCOTECH能夠降低腫瘤和免疫細胞上PDL1的表達，增加效應T細胞的浸潤，同時減少調節(jié)性T細胞的數(shù)量，這一系列作用共同提升了免疫治療的效果。
更進一步，eOA病毒的感染能夠誘導腫瘤細胞發(fā)生免疫原性死亡，釋放危險信號分子，激活免疫系統(tǒng)。同時，ONCOTECH還能夠促進樹突細胞提呈腫瘤抗原，激活腫瘤浸潤T細胞，從而增強T細胞的治療效果。
(圖片來自原文)
eOA 釋放的 Cas9 如何有效破壞腫瘤細胞 PDL1 基因？
在該研究中，研究人員設計了一種溶瘤腺病毒（OA），命名為eOA，該病毒攜帶了Cas9基因編輯系統(tǒng)以及針對PDL1基因的特定sgRNA。這一創(chuàng)新的基因編輯策略旨在直接破壞腫瘤細胞中的PDL1基因，從而提升免疫系統(tǒng)對癌細胞的攻擊能力。
研究人員首先使用eOA感染腫瘤細胞，并觀察到Cas9蛋白及其伴隨的sgRNA被成功轉錄到腫瘤細胞內。通過T7E1基因編輯檢測，他們發(fā)現(xiàn)PDL1基因發(fā)生了預期的插入和缺失突變，這表明Cas9已經(jīng)準確地編輯了目標基因。
進一步的Western blot檢測顯示，eOA感染后，腫瘤細胞中的PDL1蛋白表達顯著下降。此外，通過T7E1和Western blot檢測，研究人員還證實了eOA能夠在體內環(huán)境中破壞腫瘤細胞的PDL1基因，并有效下調PDL1蛋白的表達。
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(圖片來自原文)
如何巧妙地將病毒顆粒裝載到載體 T 細胞膜上？
在該項研究中，研究人員采用了一種創(chuàng)新的技術手段，成功地將病毒顆粒有效裝載到了T細胞的表面。這一過程涉及了精心的設計和多個步驟：
研究團隊首先利用脂質擠出法，將工程化的腺病毒（eOA）封裝到表達MHC-I-卵清蛋白復合物的B16OVA細胞膜中，從而形成了被稱為M@eOA的復合體。
接下來，研究人員利用MHC-I-卵清蛋白復合物與OT-1 CD8+ T細胞上的TCR受體之間的特異性識別作用，實現(xiàn)了M@eOA復合體在OT-1 T細胞表面的錨定，進而形成了T-M@eOA復合體。
值得注意的是，M@eOA是通過脂質雙分子層錨定在T細胞膜上，而非通過共價鍵連接，這樣的方式確保了T細胞的功能不會受到影響。
當T-M@eOA復合體到達腫瘤細胞并識別出腫瘤特異性抗原時，M@eOA能夠與T細胞競爭性地釋放到腫瘤細胞表面，并成功進入腫瘤細胞內部。這種基于抗原受體相互作用的生物物理方法，不僅能夠有效地將病毒顆粒裝載到T細胞膜上，而且為腫瘤靶向的病毒治療提供了新的策略和思路。
(圖片來自原文)
ONCOTECH如何增強體外抗腫瘤反應？
免疫細胞死亡（ICD）標記物的表達增加
當腫瘤細胞經(jīng)過T-M@eOA處理后，免疫細胞死亡（ICD）的標記物，包括鈣網(wǎng)蛋白（CRT）、熱休克蛋白70（HSP70）、ATP和HMGB1的表達水平顯著上升。這一現(xiàn)象表明T-M@eOA能夠誘發(fā)強烈的ICD效應，從而激活免疫系統(tǒng)。
抗原提呈能力的增強
實驗顯示，經(jīng)T-M@eOA處理的腫瘤細胞上清液可以增強骨髓來源的樹突狀細胞（BMDC）對MHC-I-卵清蛋白復合物的提呈能力。這意味著T-M@eOA能夠提升抗原提呈細胞的功能，進一步增強免疫應答。
T細胞增殖和效應功能的增強
T-M@eOA能夠顯著促進T細胞的增殖，并提高其分泌干擾素γ和顆粒酶B等效應分子的能力，這些都是評估T細胞功能的重要指標。
腫瘤球生長的抑制
在三維腫瘤球模型中，T-M@eOA能夠有效抑制腫瘤球的生長，這表明它能夠重塑免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，并增強T細胞的抗腫瘤功能。
基因集富集分析
通過對T-M@eOA處理后的腫瘤組織進行RNA測序和基因集富集分析，研究人員發(fā)現(xiàn)病毒蛋白與細胞因子及其受體相互作用的通路被激活，這進一步揭示了ONCOTECH作用的潛在分子機制。
綜合以上實驗結果，研究人員得出結論，ONCOTECH通過多種機制重塑了免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，并增強了T細胞的抗腫瘤功能，從而提高了抗腫瘤免疫反應的效果。
(圖片來自原文)
ONCOTECH如何增強體外抗腫瘤反應？
在該研究中，關鍵的實驗結果表明ONCOTECH療法通過多種機制改善免疫抑制性TME，激活免疫應答，并增強抗腫瘤免疫反應：
免疫抑制性TME改善
經(jīng)過T-M@eOA治療的小鼠腫瘤組織中，PD-L1的表達顯著降低。這一變化表明ONCOTECH療法有助于緩解腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)。
ICD效應增強
治療后的腫瘤細胞顯示出更高的鈣網(wǎng)蛋白（CRT）、熱休克蛋白70（HSP70）、ATP和HMGB1的表達水平，這些都是免疫細胞死亡（ICD）效應的關鍵標記物。增強的ICD效應有助于激活免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的攻擊。
抗原提呈能力提升
T-M@eOA治療不僅增加了成熟樹突細胞（DC細胞）的比例，還增強了DC細胞對SIINFEKL抗原的提呈能力，這對于啟動和維持有效的免疫反應至關重要。
免疫細胞數(shù)量增加
治療后，小鼠腫瘤組織中的M1樣巨噬細胞和內源性CD8+ T細胞數(shù)量顯著增加，而調節(jié)性T細胞（Treg細胞）的數(shù)量減少。這種變化有助于創(chuàng)建一個更有利于免疫介導的腫瘤殺傷的環(huán)境。
免疫應答激活
通過對T-M@eOA處理后的腫瘤組織進行基因集富集分析，研究人員發(fā)現(xiàn)多種與免疫相關的通路被激活，包括病毒蛋白與細胞因子受體相互作用等關鍵通路。
(圖片來自原文)
ONCOTECH治療小鼠實體瘤效果如何？
在一系列深入的實驗研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)了ONCOTECH療法在治療實體瘤方面的顯著效果。以下是關鍵的實驗結果：
小鼠黑色素瘤模型
在小鼠皮下B16OVA腫瘤模型中，T-M@eOA治療顯著抑制了腫瘤的生長，并且明顯延長了小鼠的生存期。
轉移性腫瘤模型
針對B16OVA轉移性腫瘤模型，T-M@eOA治療不僅顯著抑制了腫瘤的生長，還明顯減少了肺部轉移結節(jié)的數(shù)量，并提高了小鼠的生存期。
自發(fā)轉移腫瘤模型
在4T1-OVA自發(fā)轉移腫瘤模型中，T-M@eOA治療同樣有效地抑制了腫瘤的生長，減少了肺部轉移結節(jié)的數(shù)量，并提高了生存期。
人源化PDX模型
在更為臨床相關的人源化患者衍生腫瘤（PDX）模型中，T-M@eOA治療顯著抑制了腫瘤的生長，并且延長了生存期。
患者來源腫瘤細胞
實驗還表明，eOA能夠成功地裝載到患者來源的腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL細胞）上，并顯著殺死腫瘤細胞。
綜合這些實驗結果，研究團隊得出結論：ONCOTECH療法有效抑制實體瘤的生長，并顯著提高生存期，為實體瘤的治療提供了新的策略和希望。
(圖片來自原文)
該方法在人源化模型中的表現(xiàn)如何？
在該研究中，研究人員首先將患者來源的胰腺導管腺癌（PDAC）腫瘤組織接種到人源化NSG小鼠體內，成功構建了模擬人體腫瘤生物學特性和微環(huán)境的人源化PDX模型。接下來，科學人員使用攜帶前列腺干細胞抗原（PSCA）的293T細胞感染工程化腺病毒（eOA），制備出含有eOA的病毒微囊（MV@eOA）。研究人員利用PSCA特異性CAR-T細胞與MV@eOA中的PSCA相互作用，實現(xiàn)了MV@eOA與CAR-T細胞的物理連接，從而形成了CAR-T-MV@eOA嵌合體。
將制備好的CAR-T-MV@eOA嵌合體通過靜脈注射到人源化PDX小鼠體內，觀察其對腫瘤生長、生存期、PD-L1表達以及免疫細胞數(shù)量等指標的影響，以評估其抗腫瘤作用。為了評估CAR-T-MV@eOA治療的長期效果，研究人員對人源化PDX小鼠進行了造血干細胞（HSC）重建，并重復以上治療過程。
通過這一系列精心設計的實驗，研究人員證實了CAR-T-MV@eOA嵌合體在人源化PDX模型中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果。
(圖片來自原文)
綜上所述，ONCOTECH作為一種結合病毒治療和細胞治療的技術，展現(xiàn)了良好的臨床轉化潛力。
翌圣助力產(chǎn)品
在該研究中，研究團隊使用了翌圣生物染料法熒光定量qPCR試劑進行病毒拷貝數(shù)分析及基因表達分析：
(圖片來自原文)
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[2] Seki T, Yang Y, Sun X, et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 2022;608(7922):421-428. doi:10.1038/s41586-022-05030-3. (IF=69.504)
[3] Chen P, Wang W, Liu R, et al. Olfactory sensory experience regulates gliomagenesis via neuronal IGF1. Nature. 2022;606(7914):550-556. doi:10.1038/s41586-022-04719-9.(IF=69.504)
[4] Dong W, Zhu Y, Chang H, et al. An SHR-SCR module specifies legume cortical cell fate to enable nodulation. Nature. 2021;589(7843):586-590. doi:10.1038/s41586-020-3016-z.(IF=69.504)
[5] Lu XY, Shi XJ, Hu A, et al. Feeding induces cholesterol biosynthesis via the mTORC1-USP20-HMGCR axis. Nature. 2020;588(7838):479-484. doi:10.1038/s41586-020-2928-y.(IF=69.504)
[6] Bi X, Wang K, Yang L, et al. Tracing the genetic footprints of vertebrate landing in non-teleost ray-finned fishes. Cell. 2021;184(5):1377-1391.e14. doi:10.1016/j.cell.2021.01.046.(IF=66.850)
[7] Liu S, Hua Y, Wang J, et al. RNA polymerase III is required for the repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination. Cell. 2021;184(5):1314-1329.e10. doi:10.1016/j.cell.2021.01.048.(IF=66.850)
[8] Liu CX, Li X, Nan F, et al. Structure and Degradation of Circular RNAs Regulate PKR Activation in Innate Immunity. Cell. 2019;177(4):865-880.e21. doi:10.1016/j.cell.2019.03.046.(IF=66.850)
[9] Han X, Wang R, Zhou Y, et al. Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-Seq. Cell. 2018;172(5):1091-1107.e17. doi:10.1016/j.cell.2018.02.001.(IF=66.850)
[10] Chai Q, Yu S, Zhong Y, et al. A bacterial phospholipid phosphatase inhibits host pyroptosis by hijacking ubiquitin. Science. 2022;378(6616):eabq0132. doi:10.1126/science.abq0132.(IF=63.714)
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