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2023年11月16日，Vertex Pharmaceuticals和CRISPR Therapeutics共同宣布基因編輯療法產(chǎn)品CASGEVY™（Exagaglogene autotemcel）獲英國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)MHRA有條件批準(zhǔn)上市，用于治療治療鐮狀細(xì)胞病（SCD）和輸血依賴性β-地中海貧血（TDT），是獲批上市的CRISPR基因編輯藥物。
圖1. CASGEVY™治療流程（Source：CRISPR Therapeutics）
CASGEVY™療法是基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的治療方案，CRISPR/Cas9系統(tǒng)因?yàn)槠浜?jiǎn)單性和易于RNA編程的潛力，是所有CRISPR-Cas系統(tǒng)中用于基因工程開發(fā)的最佳候選系統(tǒng)。目前基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于治療、育種、合成生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。
CRISPR基因編輯技術(shù)，除了CRISPR/Cas9體系外，CRISPR/Cas12a體系正憑借其優(yōu)勢(shì)逐漸嶄露頭角。與CRISPR/Cas9體系相比，CRISPR/Cas12a體系在核酸酶結(jié)構(gòu)域、向?qū)NA（gRNA）以及產(chǎn)生的DNA末端類型等方面都有著顯著的差異，詳見下表：
圖2. Cas9系統(tǒng)與Cas12系統(tǒng)對(duì)比[1]
除以上差異外，Cas12a在切割活性方面也與Cas9存在顯著區(qū)別。Cas9僅具有順式切割活性，用于DNA雙鏈斷裂。而Cas12a不僅具有順式切割活性，還具備的反式切割活性，這使得它在基因編輯領(lǐng)域展現(xiàn)出更為廣泛的應(yīng)用潛力。
CRISPR/Cas12a切割活性
順式切割活性
Cas12a由單個(gè)crRNA引導(dǎo)，當(dāng)形成crRNA-Cas12a復(fù)合物時(shí)，它的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化。然后，該復(fù)合物識(shí)別DNA非靶標(biāo)鏈中特定的PAM位點(diǎn)。在距離PAM位點(diǎn)8個(gè)核苷酸（nt）的位置，RuVC結(jié)構(gòu)域切割DNA靶標(biāo)鏈，產(chǎn)生5’端的粘性突出末端。
反式切割活性
Cas12a能夠特異性地識(shí)別并切割雙鏈DNA（dsDNA），隨后釋放單鏈脫氧核糖核酸酶（ssDNase）活性。這種活性使得Cas12a能夠無(wú)差別地裂解附近的單鏈DNA（ssDNA）。因此，Cas12a系統(tǒng)可以與LAMP等核酸檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，為核酸檢測(cè)、病原體識(shí)別等領(lǐng)域提供高效、靈敏且便捷的工具，展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。
圖3. Cas12a順式及反式切割活性[2]
基于CRISPR/Cas12a廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景，翌圣鎂孚泰生物ZymeEditor（點(diǎn)擊了解更多）酶改造及發(fā)酵純化工藝平臺(tái)新開發(fā)了來源于細(xì)菌Agathobacter rectalis的ArCas12a，與其它Cas12a（LbCas12a/AsCas12a）相比，其具有更高的溫度適應(yīng)性（25-55℃），非常適用于基因組編輯及核酸檢測(cè)等應(yīng)用場(chǎng)景。
ArCas12a性能展示
dsDNA高效體外切割
以dsDNA模板為靶標(biāo)，加入ArCas12a、crRNA（存在與模板DNA序列互補(bǔ)的spacer區(qū)）進(jìn)行體外切割，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)切割效果。結(jié)果顯示翌圣的ArCas12a在crRNA的引導(dǎo)下可高效的切割dsDNA（600 bp）產(chǎn)生兩段切割產(chǎn)物（200 bp+400 bp）。
圖4. ArCas12a順式切割活性檢測(cè) M：Marker；C：模板dsDNA
反式切割活性強(qiáng)，可用于核酸檢測(cè)
以dsDNA模板為靶標(biāo)，加入ArCas12a、crRNA（存在與模板DNA序列互補(bǔ)的spacer區(qū)）及單鏈DNA報(bào)告探針（含有熒光報(bào)告集團(tuán)）進(jìn)行體外切割，當(dāng)ArCas12a與crRNA及靶標(biāo)DNA形成復(fù)合體后會(huì)激活反式切割活性，切割單鏈DNA報(bào)告探針，從而發(fā)出熒光。結(jié)果顯示，翌圣ArCas12a與crRNA及模板DNA形成復(fù)合體后具有反式切割活性，可剪切單鏈DNA。
圖5. ArCas12a反式切割活性檢測(cè)
無(wú)核酸外切酶殘留
將底物DNA與10 pmol ArCas12a共同孵育，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示翌圣的ArCas12a無(wú)核酸外切酶殘留。
圖6. ArCas12a核酸外切酶殘留檢測(cè) C：陰性對(duì)照
無(wú)RNase殘留
將底物RNA與5 pmol ArCas12a共同孵育，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示翌圣的ArCas12a無(wú)RNase殘留。
圖7. ArCas12a RNase酶殘留檢測(cè) C：陰性對(duì)照
產(chǎn)品推薦
產(chǎn)品分類 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
Cas12a | ArCas12a Nuclease | 14702ES |
Lbcpf1 (Cas12) Nuclease | 11354ES | |
Fncpf1(Cas12) Nuclease | 11353ES | |
Ascpf1(Cas12) Nuclease | 11352ES | |
Cas12b | AapCas12b Nuclease | 14808ES |
Cas9 | Cas9 Nuclease | 14701ES |
NLS-Cas9-EGFP Nuclease | 11364ES | |
sgRNA合成 | Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit | 11355ES |
