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隨著糖蛋白質(zhì)組學(xué)和抗體藥研究的迅速發(fā)展，糖基化修飾也備受關(guān)注。細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與病原體的接觸主要是通過糖與蛋白質(zhì)相互作用完成的，糖基化決定了糖復(fù)合物的粘附特性。在IgG中，F(xiàn)c區(qū)Asn297處的保守N-連接糖對(duì)其活性也至關(guān)重要。此外，一些抗體還具有額外的N-糖鏈，與 Fc區(qū) Asn297處的保守位點(diǎn)一起影響抗體的識(shí)別、半衰期和免疫反應(yīng)。
蛋白質(zhì)糖基化是一種復(fù)雜的翻譯后修飾，涉及糖鏈在蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)的連接，依據(jù)糖鏈類型的差異，糖蛋白被分為N-連接糖蛋白、O-連接糖蛋白等；另外，蛋白質(zhì)糖基化還受到宿主細(xì)胞類型和發(fā)酵條件（如培養(yǎng)基、pH值、溫度等）波動(dòng)的影響。因此，糖蛋白在糖基化模式上通常具有異質(zhì)性，包括糖基化位點(diǎn)、糖基化程度以及糖鏈的具體結(jié)構(gòu)，使得糖鏈分析和結(jié)構(gòu)表征工作具挑戰(zhàn)，為了程度上獲得糖鏈結(jié)構(gòu)信息，目前糖鏈分析的主要策略是先把糖鏈從蛋白上游離下來，然后進(jìn)行詳細(xì)的分析表征。在此策略中，高效、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的去糖基化方法至關(guān)重要。
酶促法是目前應(yīng)用比較廣泛的去糖基化方法。
其中PNGase F (N-糖苷酶 F)是去除糖蛋白中幾乎所有 N-連接寡糖的有效的酶促方法，可以裂解由天冬酰胺連接的高甘露糖、雜合和復(fù)雜的寡糖糖蛋白，特異性除去N-連接糖。切割位點(diǎn)為：最內(nèi)側(cè)N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和天冬酰胺殘基之間的酰胺鍵，同時(shí)將酶解后蛋白上的天冬氨酰轉(zhuǎn)化為天冬氨酸。
當(dāng)α1-6巖藻糖位于GlcNAc核心時(shí)，PNGase F也可以切割；只有當(dāng)α1-3巖藻糖位于GlcNAc核心時(shí)（常見于植物和昆蟲糖蛋白），PNGase F不能切割。
但常規(guī)PNGase F酶促反應(yīng)釋放抗體N-聚糖需要長(zhǎng)達(dá)幾小時(shí)，同時(shí)由于聚糖釋放存在偏好性，不全的去糖基化可能導(dǎo)致結(jié)果的偏差，所獲得的聚糖分布不能代表治療性抗體的正確組成。因此，盡量在最短時(shí)間內(nèi)獲得準(zhǔn)確的 N-糖鏈糖譜對(duì)于抗體及抗體融合蛋白等生物治療劑生產(chǎn)過程中糖基化監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。
Fast PNGase F，N-糖苷酶 F（快速版）是一種經(jīng)過優(yōu)化的重組試劑,可以在數(shù)分鐘內(nèi)對(duì)抗體、免疫球蛋白、融合蛋白以及其他糖蛋白進(jìn)行快速的去糖基化。此酶能夠迅速且無偏好性地去除所有的 N-糖鏈，并且可直接進(jìn)行下游的色譜或質(zhì)譜分析。翌圣Fast PNGase F，N-糖苷酶 F（快速版） 簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，可在保證靈敏度和重復(fù)性的前提下減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
產(chǎn)品特點(diǎn)
速度快：數(shù)分鐘內(nèi)進(jìn)行快速的去糖基化；
純度高：無蛋白酶、糖苷酶污染，純度≥95%；
無偏好性：迅速且無偏好性地去除所有的 N-糖鏈；
兼容性好：可直接進(jìn)行下游的色譜或質(zhì)譜分析。
測(cè)試數(shù)據(jù)
一步法蛋白質(zhì)去糖基化
10 ug底物/100 ug抗體和ddH2O混合至16 uL的總體積；
加入4 μL的Fast PNGase F Buffer（5x），終體積為20 uL；
加入1 μL的Fast PNGase F；
在50℃下孵育10分鐘。
兩步法蛋白質(zhì)去糖基化：
10 ug底物/100 ug抗體和ddH2O混合至16 uL的總體積；
加入4 μL的Fast PNGase F Buffer（5x），終體積為20 uL；
在80℃下孵育2分鐘，冷卻至室溫；
加入1 μL的Fast PNGase F；
在50℃下孵育10分鐘。
結(jié)論
1.翌圣Fast PNGase F在同等反應(yīng)條件下同進(jìn)口競(jìng)品有著等同的酶切效率或高于進(jìn)口競(jìng)品；
2.推薦進(jìn)行兩步法酶切，可保證更高的酶切效率。某些抗體（如Fab N-糖基化）需要預(yù)熱步驟來進(jìn)行高效的脫糖基化。
另外，我司還提供常規(guī)PNGase F，包括PNGase F, N-糖苷酶 F（Cat#20407ES，比活性：100000 U/mL），PNGase F, N-糖苷酶 F（Cat#20415ES，比活性：750000 U/mL），以及其他類型的糖苷酶，如Endo H糖苷內(nèi)切酶H（Cat#20414ES），Endo S糖苷內(nèi)切酶S（Cat#20413ES）。
貨號(hào) | 20406ES | 20407ES | 20415ES | 20414ES | 20413ES |
產(chǎn)品 名稱 | Fast PNGase F | PNGase F | PNGase F | Endo H | Endo S |
來源 | 酵母重組表達(dá) | 酵母重組表達(dá) | 酵母重組表達(dá) | 酵母重組表達(dá) | 大腸桿菌表達(dá) |
比活 | 不適用 | 100000U/mL | 750000U/mL | 1000000U/mL | 8000 U/mg |
切割 位點(diǎn) | 幾乎所有的N-連接糖 | 幾乎所有的N-連接糖 | 幾乎所有的N-連接糖 | N-連接高甘露糖 | 從 IgG 重鏈的殼二糖核心結(jié)構(gòu)之間切除N-連接糖 |
酶切 時(shí)間 | 10 min | 1-3 h | 1-3 h | 1-3 h | 1 h |
糖組學(xué) | 適合 | 適合 | 適合 | 適合 | 適合 |
蛋白質(zhì)組學(xué) | 適合 | 適合 | 適合 | 適合 | 適合 |
產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
Fast PNGase F, N-糖苷酶 F(快速版) | 20406ES20/50 | 20 T/50 T |
PNGase F (N-糖酰胺酶F或肽N-糖苷酶 F） | 20407ES01/02 | 15000 U /75000 U |
PNGase F, Recombinant, Expressed in Yeast 酵母重組表達(dá)N-糖苷酶 F | 20415ES01/02 | 15 kU/75 kU |
Endo H糖苷內(nèi)切酶H | 20414ES92/97 | 10000 U /50000 U |
Endo S糖苷內(nèi)切酶S | 20413ES80/90 | 1000 U/ 5 x 1000 U |
產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
IdeS Protease(免疫球蛋白G降解酶) | 20412ES84/90 | 2000 U/5000 U |
