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細胞貼壁原理
大部分來自實體組織器官的細胞都會貼壁，但不是所有的細胞在體外培養(yǎng)的情況下都會貼壁。許多細胞必須添加促貼壁物質才能貼壁生長，促貼壁物質一般為細胞外基質，如纖連蛋白、層粘連蛋白、玻連蛋白和膠原蛋白等。
細胞首先分泌細胞外基質，這種細胞外基質黏附在支持物的表面（如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿的底面）。細胞通過其表面的黏附因子與這些細胞外基質結合。所以細胞貼壁與否與細胞本身分泌細胞外基質的能力以及細胞本身表達的黏附分子的數(shù)量有關，也與培養(yǎng)皿壁的表面結構和培養(yǎng)基中的黏附蛋白有關。
是眾多介導細胞間或細胞與細胞之間相互接觸和結合分子的統(tǒng)稱。
是由動物細胞合并分泌到胞外、分布在細胞表面或細胞之間的大分子。
二者大多數(shù)均為糖蛋白，因此具有較強的親水性。因此細胞貼壁與否和細胞本身分泌細胞外基質的能力以及細胞本身表達的黏附分子的數(shù)量有關，也與有無合適的底物（培養(yǎng)瓶）有關。大多數(shù)的哺乳動物細胞在體內和體外均附著于一定的底物而生長，在體外時這些底物可以是其他細胞、膠原、玻璃或塑料等。
膠原蛋白（Collagen）
膠原蛋白是支持細胞和組織生長的重要胞外基質蛋白，其形成的胞外環(huán)境有利于多種細胞的粘附、生長、遷移和分化。膠原主要包括I型膠原，Ⅱ型膠原，Ⅲ型膠原，Ⅳ型膠原，Ⅴ型膠原，Ⅵ型膠原幾種。
I 型膠原—最常見的膠原蛋白，促進細胞的貼壁和增殖，用于內皮細胞，肝細胞，肌細胞等的培養(yǎng)。
軟骨細胞對II型膠原的黏附性較好；上皮細胞在Ⅳ型膠原底物上貼壁良好，而在I、II、III型膠原底物的培養(yǎng)板上貼壁情況較差。膠原應用及建議細胞基質濃度。
表1.不同膠原蛋白包被濃度
細胞外基質 | 建議濃度 | 內皮細胞 | 上皮細胞 | 神經(jīng)元細胞 | 神經(jīng)膠質細胞 | 軟骨細胞 | 肝細胞 | 骨骼肌細胞 |
Collagen I | 0.2-10μg/cm2 | |||||||
Collagen Ⅱ | 5μg/cm2 | |||||||
Collagen Ⅲ | 0.2-10μg/cm2 | |||||||
Collagen Ⅳ | 1-10μg/cm2 | |||||||
Collagen Ⅵ | 1-5μg/cm2 |
PART3
纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）
細胞纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）是一種細胞外糖蛋白，分別以可溶形式存在于體液中，或以不可溶形式存在于細胞外基質中。作為主要的細胞粘附分子之一，F(xiàn)N 在許多重要的生理過程中起著關鍵性作用，如胚胎生成，傷口愈合，止血和血 栓形成。纖連蛋白表達的改變，降解以及組合與大量的病理發(fā)生密切相關，包括癌癥和纖維化。
重組纖維連接蛋白，可作為一種細胞培養(yǎng)基質，替換Matrigel、鼠尾膠原、血源纖連蛋白等，提高細胞貼壁率，增強細胞代謝水平，縮短細胞生長周期。也可直接添加到培養(yǎng)基中，替換或降低血清使用量，促進細胞貼壁、遷移、移動生長、維持細胞狀態(tài)。
Human FN包被方法（以6孔板為例）
母液配制：用20mM 檸檬酸鹽，250mM NaCl，pH7.2~7.4溶解重組人纖維連接蛋白(rFN)，建議配置 1mg/mL 的儲存液。母液按照單次使用劑量，分裝凍存于-20 ℃，避免反復凍融；
取出適量的重組人纖維連接蛋白（rFN），用無菌1×PBS，pH 7.2~7.4稀釋至工作液濃度，終濃度參考范圍50~100 μg/mL?；靹蚝螅尤氲?孔板中，800μL/孔，保證工作液全覆蓋6孔板底部；
將加有rFN工作液的6孔板，放置在4 ℃過夜或者37 ℃包被1 h；
收集6孔板中的工作液，放置4 ℃保存，一周內可用于其他培養(yǎng)瓶/板包被；
取出rFN包被后的6孔板，加入正常的細胞培養(yǎng)基后，可直接接種細胞，rFN促進細胞貼壁、生長等；
若包被后的6孔板暫不使用，放置在4 ℃密封保存，建議一周內使用完。
【注】：包被/鋪板實驗中，重組人纖維連接蛋白（rFN）工作液的加入量，應根據(jù)培養(yǎng)皿/瓶的大小進行調整，請參見下表2。
表2. 重組人纖維連接蛋白包被濃度
培養(yǎng)皿 | 底面積 (cm2) | 推薦rFN工作液加入量 |
96孔板 | 0.32 | 50 μL |
24孔板 | 2 | 200 μL |
12孔板 | 4.5 | 400 μL |
6孔板 | 9.6 | 800 μL |
35 mm培養(yǎng)皿 | 8 | 600 μL |
60 mm培養(yǎng)皿 | 21 | 1.6 mL |
25 cm2培養(yǎng)瓶 | 25~28 | 2.0 mL |
玻連蛋白（Vitronectin），又稱S-蛋白或血清擴散因子，是一種在肝臟中合成的分泌型糖蛋白，屬于小分子蛋白，借由Vitronectin 受體讓細胞貼附于細胞基質中，主要促進細胞遷移，增加細胞貼附性、細胞分裂、細胞生長分化等，并協(xié)助細胞間的訊號傳遞。
Human VTN蛋白包被方法
本方案僅作參考，具體包被條件需要根據(jù)細胞培養(yǎng)體系進行優(yōu)化
取出重組人玻連蛋白，用無菌1×PBS，復溶至濃度0.1- 1 mg/mL?；靹蚝?，用培養(yǎng)基稀釋至5- 20μg/mL工作液濃度；
根據(jù)實驗所用培養(yǎng)器皿，參考下表3.建議的包被量進行包被。包被時，使包被液均勻覆蓋在培養(yǎng)皿表面，37℃孵育1小時以上。37℃過夜包被，效果更佳；
使用時，吸去培養(yǎng)容器表面的Human VTN工作液，將細胞直接接種到培養(yǎng)器皿中。
【注】：VTN的工作濃度與不同細胞系密切相關，請根據(jù)不同細胞系對VTN包被濃度進行適當調整。避免使用在4℃保存24小時以上的、配制好的VTN包被液進行包被。
表3. Human VTN 包被不同培養(yǎng)器皿的建議使用體積
層粘連蛋白（Laminin）
層粘連蛋白是細胞外基質的重要組成，存在于所有上皮細胞和內皮細胞的基底側，同時也是某些細胞與細胞間交互作用的中間媒介。層粘連蛋白對于生物活性至關重要，影響細胞分化、生長、遷移和粘附等。層粘連蛋白是一種細胞外基質多結構域三聚糖蛋白，是基底層的主要非膠原成分，支持粘附、增殖和分化。層粘連蛋白由A、B1和B2鏈組成，這些鏈由許多二硫鍵連接。層粘連蛋白支持多種細胞類型的生長和分化，包括上皮細胞、內皮細胞、神經(jīng)細胞、肌肉細胞和肝細胞。Laminin 521已成為大規(guī)模擴增誘導多能干細胞 (iPSC) 最有前景的涂層系統(tǒng)。
Laminin 521一般使用步驟（僅供參考）：
用Laminin 521包被細胞培養(yǎng)介質（常見用量為0.5 μg/cm2，具體視實驗而定）；
清洗細胞，加入消化酶或EDTA孵育；
分離成單細胞懸液，離心，并在合適的新鮮培養(yǎng)基中重懸；
將細胞接種在已用Laminin 521包被的培養(yǎng)介質上。。
Poly-D-lysine 多聚-D-賴氨酸
和Poly-L-lysine 多聚-L-賴氨酸
Poly-lysine多聚賴氨酸，是一種帶正電荷的氨基酸聚合物，包被在培養(yǎng)器皿表面，不僅能促進細胞的貼壁，還能加強對血清蛋白和細胞外基質蛋白的吸附，也可用作組織學分析的粘片劑。多聚賴氨酸分為D型和 L型。
Poly-D-lysine多聚-D-賴氨酸（PDL）和Poly-L-lysine多聚-L-賴氨酸（PLL）分子量為150000~300000，都可促進細胞的貼壁生長，常用的濃度是0.1 mg/mL。2個產品的區(qū)別在于PDL不會被細胞吸收，但PLL可以被某些細胞吸收，攝入過多會產生一定的細胞毒性。
細胞培養(yǎng)一般步驟如下：
用PBS或者無菌水將poly-D-lysine或者poly-L-lysine配制成濃度為0.1 mg/mL的溶液后進行無菌過濾；
將過濾后的poly-D-lysine/poly-L-lysine溶液倒入培養(yǎng)器皿，使用量為0.5~1.0 mL/25cm2，輕輕搖晃，使其均勻覆蓋在培養(yǎng)器皿表面；
5~10 min后，用移液器吸出溶液，用PBS清洗培養(yǎng)器皿表面；
干燥2~3h后，可進行細胞培養(yǎng)。
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產品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 目錄價（元） | 價（元） |
重組人玻連蛋白（Vitronectin） | 92549ES10/60 | 10μg/100μg | 255/985 | 128/493 |
重組人纖連蛋白（Fibronectin） | 40113ES03/10 | 1mg/10mg | 655/3355 | 528/2688 |
重組人層粘連蛋白521（Laminin 521 ） | 92602ES10/60 | 10μg/100μg | 575/2285 | 288/1143 |
大鼠鼠尾膠原蛋白I（Collagen, Type I） | 40125ES10/50 | 2mL/10 mL | 586/2236 | 380/1520 |
小鼠鼠尾膠原蛋白I（Collagen, Type I） | 40136ES10/50 | 2mL/10 mL | 685/2685 | 615/2415 |
重組人III型膠原蛋白（Type III Collagen） | 92616ES50/72 | 50μg/250μg | 485/1215 | 240/608 |
多聚-D-賴氨酸 (Poly-D-lysine) | 60715ES08/10/50 | 5mg/10mg | 455/725 | 364/580 |
多聚-L-賴氨酸 (Poly-L-lysine) | 60716ES08/10/50 | 5mg/10mg | 385/635 | 308/508 |
