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通常我們做完熒光定量PCR后，會(huì)通過(guò)下機(jī)數(shù)據(jù)來(lái)分析基因表達(dá)情況。這篇干貨將會(huì)給大家詳細(xì)分享熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理方法，希望能給小伙伴們一定的幫助。
相對(duì)定量法中常見(jiàn)的是比較Ct法，其中主要包括△△Ct法，Pfaffl法和△CT法，目前諸多科研人員采用最多的是△△Ct法。雖然該方法應(yīng)用廣泛，但是很多人卻不了解其中的原理。知其然，知其所以然。小翌接下來(lái)給小伙伴們講一下△△Ct法的原理。
△△Ct法原理
Ct值：每個(gè)反應(yīng)管中熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)。起始模板拷貝數(shù)越多， Ct值則越小。
理論條件下，DNA擴(kuò)增是以半保留復(fù)制的形式每個(gè)循環(huán)增加一倍，由100條變200條，由200條變400條，由400條變800條等等，用數(shù)學(xué)表達(dá)式來(lái)說(shuō)就是2^Ct。但是實(shí)際情況中，擴(kuò)增效率不是100%的，增量的表達(dá)形式則變成了(1+e)^Ct，其中e表示的是擴(kuò)增效率。
擴(kuò)增產(chǎn)量=起始模板量×(1+e)^Ct
由于不同反應(yīng)條件下，e值不一樣，為便捷地計(jì)算，分析數(shù)據(jù)時(shí)將e默認(rèn)為100%，那么擴(kuò)增產(chǎn)量=起始模板量×2^Ct。
看到這，有小伙伴可能會(huì)想，在一樣的產(chǎn)物量(熒光信號(hào)水平)下，比較Ct值，那我就可以比較不同實(shí)驗(yàn)組的起始模板量，是不是就可以得出基因表達(dá)差異的結(jié)果了。然而事實(shí)并非如此，不同實(shí)驗(yàn)組難以保證上樣量的一致性、生物本身的一致性、整體操作誤差的一致性，做出來(lái)的結(jié)果是有偏差的，甚至可能是相反的。這里給小伙伴們舉個(gè)例子。
測(cè)試一款減少黑色素表達(dá)的藥物，該藥物以灌胃的形式給藥至實(shí)驗(yàn)組小鼠，對(duì)照組小鼠僅以正常飲用水進(jìn)行灌胃，以往大量研究已表明該藥物對(duì)于黑色素表達(dá)有明顯的抑制作用。
如果研究目的基因，簡(jiǎn)單僅以兩組的目的基因表達(dá)量相比，可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組生成黑色素的基因表達(dá)量相比于對(duì)照組要多四倍。
然而已有大量研究證明該藥物抑制黑色素表達(dá)，計(jì)算結(jié)果與已有理論存在相悖的情況(也有可能是發(fā)現(xiàn)了新課題o(*￣▽￣*)ブ)。為什么會(huì)出現(xiàn)這個(gè)結(jié)果呢？其原因可能主要是兩組小鼠RNA提取的時(shí)候處于不同的時(shí)間、提取樣本量不一樣、cDNA上樣量不一樣、cDNA濃度不一樣等等。
為避免各類潛在差異帶來(lái)的影響，需引入內(nèi)參基因，可見(jiàn)上圖右半部分。內(nèi)參基因通常是一種始終保持著低水平甲基化且一致處于活性轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的基因，高度保守且在大多數(shù)情況下持續(xù)表達(dá)，其表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小。通常在檢測(cè)基因的表達(dá)水平時(shí)用作參照物，可用以校正操作、上樣量差異等帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)誤差，從而保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。
同樣樣本，在原測(cè)試目的基因的基礎(chǔ)上，加測(cè)內(nèi)參基因。對(duì)照組得到的目的基因與內(nèi)參基因之間的模板比值為正常老鼠目的基因的比例關(guān)系，理論狀態(tài)下，以該比例×實(shí)驗(yàn)組老鼠恒定表達(dá)的內(nèi)參基因表達(dá)量即可獲得實(shí)驗(yàn)組老鼠在正常狀態(tài)下目的基因的理論表達(dá)量，實(shí)際實(shí)驗(yàn)組老鼠目的基因表達(dá)量除以理論表達(dá)值，即可計(jì)算出老鼠在藥物處理下，目的基因的表達(dá)量變化情況，具體如下：
以上結(jié)果可以得出，實(shí)驗(yàn)組目的基因表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的1/2，也符合以往研究報(bào)道。
是不是小伙伴們以為△△Ct法原理的描述到這里就結(jié)束了？不不不，我們上文中有提到實(shí)際情況中擴(kuò)增產(chǎn)量=起始模板量×(1+e)^Ct，為便捷計(jì)算，分析數(shù)據(jù)時(shí)將擴(kuò)增效率e默認(rèn)為100%，那么擴(kuò)增產(chǎn)量=起始模板量×2^Ct。我們?cè)趯?shí)際做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，也要注意內(nèi)參基因和目的基因所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增效率控制在接近100%或者基本一致，否則△△Ct法得出的結(jié)果和實(shí)際情況會(huì)有出入。
如上表格，若內(nèi)參基因和目的基因擴(kuò)增效率上未控制在基本一致或接近100%，則在使用△△Ct法上會(huì)有一定的偏差風(fēng)險(xiǎn)。
數(shù)據(jù)處理案例解析
假設(shè)目前需要研究甲藥物對(duì)小鼠X基因表達(dá)的影響，以未經(jīng)過(guò)任何處理的小鼠作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組為經(jīng)過(guò)不同量藥物處理過(guò)的小鼠，分別提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以得到的cDNA為模板，選擇小鼠GAPDH基因作為內(nèi)參，進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。
上機(jī)設(shè)置的qPCR孔如下
圖示說(shuō)明：
1）NTC：以水代替模板，用來(lái)驗(yàn)證PCR體系中是否存在污染，每一對(duì)引物都需要做NTC；
2）NRC：是指用未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板，是對(duì)gDNA殘留的控制，每一個(gè)樣本都需要做NRC；
3）生物學(xué)重復(fù)：不同的樣本（ABC）；
4）技術(shù)重復(fù)：實(shí)際上就是同一材料包括的復(fù)孔（123）。
下機(jī)處理的Excel數(shù)據(jù)如下
圖示說(shuō)明：
1）0mg：未經(jīng)過(guò)任何處理的小鼠-對(duì)照組；
2）④：對(duì)照組校正后的數(shù)值；
3）③/④：每個(gè)小組校正后的數(shù)值比上對(duì)照組校正后的數(shù)值；
4）注意圖表上的數(shù)據(jù)在excel中采用了保留2位小數(shù)的形式，實(shí)際計(jì)算時(shí)不可忽略小數(shù)點(diǎn)后的所有數(shù)字，減少按數(shù)字的動(dòng)作，活用Excel。
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[2] Seki T, Yang Y, Sun X, et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 2022;608(7922):421-428. doi:10.1038/s41586-022-05030-3. (IF=69.504)
[3] Chen P, Wang W, Liu R, et al. Olfactory sensory experience regulates gliomagenesis via neuronal IGF1. Nature. 2022;606(7914):550-556. doi:10.1038/s41586-022-04719-9.(IF=69.504)
[4] Dong W, Zhu Y, Chang H, et al. An SHR-SCR module specifies legume cortical cell fate to enable nodulation. Nature. 2021;589(7843):586-590. doi:10.1038/s41586-020-3016-z.(IF=69.504)
[5] Lu XY, Shi XJ, Hu A, et al. Feeding induces cholesterol biosynthesis via the mTORC1-USP20-HMGCR axis. Nature. 2020;588(7838):479-484. doi:10.1038/s41586-020-2928-y.(IF=69.504)
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[7] Liu S, Hua Y, Wang J, et al. RNA polymerase III is required for the repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination. Cell. 2021;184(5):1314-1329.e10. doi:10.1016/j.cell.2021.01.048.(IF=66.850)
[8] Liu CX, Li X, Nan F, et al. Structure and Degradation of Circular RNAs Regulate PKR Activation in Innate Immunity. Cell. 2019;177(4):865-880.e21. doi:10.1016/j.cell.2019.03.046.(IF=66.850)
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[10] Chai Q, Yu S, Zhong Y, et al. A bacterial phospholipid phosphatase inhibits host pyroptosis by hijacking ubiquitin. Science. 2022;378(6616):eabq0132. doi:10.1126/science.abq0132.(IF=63.714)
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[16] Xiao J, Li W, Zheng X, et al. Targeting 7-Dehydrocholesterol Reductase Integrates Cholesterol Metabolism and IRF3 Activation to Eliminate Infection. Immunity. 2020;52(1):109-122.e6. doi:10.1016/j.immuni.2019.11.015.(IF=43.474)
[17] Zhang X, Zhang C, Qiao M, et al. Depletion of BATF in CAR-T cells enhances antitumor activity by inducing resistance against exhaustion and formation of central memory cells. Cancer Cell. 2022;40(11):1407-1422.e7. doi:10.1016/j.ccell.2022.09.013.(IF=38.585)
[18] Wang XY, Wei Y, Hu B, et al. c-Myc-driven glycolysis polarizes functional regulatory B cells that trigger pathogenic inflammatory responses. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):105. Published 2022 Apr 18. doi:10.1038/s41392-022-00948-6.(IF=38.104)
[19] Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):275. Published 2020 Nov 24. doi:10.1038/s41392-020-00408-z.(IF=38.104)
[20] Ren Y, Wang A, Wu D, et al. Dual inhibition of innate immunity and apoptosis by human cytomegalovirus protein UL37x1 enables efficient virus replication. Nat Microbiol. 2022;7(7):1041-1053. doi:10.1038/s41564-022-01136-6.(IF=30.964)
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