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環(huán)狀RNA（circRNA）是一類的非編碼RNA分子，它們通過(guò)一種稱為后剪接（back splicing）的機(jī)制形成，即前體mRNA的兩個(gè)外顯子在剪接過(guò)程中連接成一個(gè)閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從而避免了線性RNA分子常見的5'帽子和3'尾巴結(jié)構(gòu)。這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)賦予了circRNA較高的穩(wěn)定性，使其不易被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降解，因此它們?cè)诩?xì)胞中的半衰期較長(zhǎng)，可以使其在實(shí)際應(yīng)用端可以達(dá)到低劑量長(zhǎng)時(shí)效的效果。此外circRNA因?yàn)椴恍枰揎椇塑蘸图用奔游驳炔僮?，所以還有相對(duì)簡(jiǎn)單的生產(chǎn)工藝優(yōu)勢(shì)，使得環(huán)狀RNA 成為藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。
其在藥物研發(fā)中具備較大的優(yōu)勢(shì)，細(xì)節(jié)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：
circRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其對(duì)核酸酶的降解具有抵抗力，因此在細(xì)胞內(nèi)具有更長(zhǎng)的半衰期和更高的穩(wěn)定性，這對(duì)于藥物的持久效果至關(guān)重要。
相較于線性RNA，circRNA具有更低的免疫原性，這減少了可能的免疫反應(yīng)，使得circRNA更適合作為藥物載體。
circRNA在多種疾病治療中顯示出潛力，包括罕見疾病、腫瘤治療以及作為疫苗開發(fā)的一部分。
正在開發(fā)的新型遞送系統(tǒng)，如脂質(zhì)納米顆粒（LNPs），可以有效地將circRNA遞送到目標(biāo)細(xì)胞，這對(duì)于藥物的靶向性和療效至關(guān)重要。正在開發(fā)的新型遞送系統(tǒng)，如脂質(zhì)納米顆粒（LNPs），可以有效地將circRNA遞送到目標(biāo)細(xì)胞，這對(duì)于藥物的靶向性和療效至關(guān)重要。
circRNA疫苗在開發(fā)中顯示出了潛力，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的中和抗體和有效的T細(xì)胞反應(yīng)，且在環(huán)境溫度下比線性mRNA更穩(wěn)定，有助于簡(jiǎn)化儲(chǔ)存和運(yùn)輸條件。
circRNA在基因編輯領(lǐng)域也顯示出潛力，可以作為基因編輯系統(tǒng)的模板，提供更持久和穩(wěn)定的蛋白表達(dá)。
circRNA生產(chǎn)過(guò)程包括：模板制備、體外轉(zhuǎn)錄、DNA模板去除、環(huán)化和純化。在RNA環(huán)化后需要用核糖核酸酶R (Ribonuclease R, RNase R)對(duì)未環(huán)化的RNA進(jìn)行消化，達(dá)到富集circRNA的目的。當(dāng)前主流使用的RNase R主要為進(jìn)口品牌，存在價(jià)格高、貨期久等問(wèn)題，不適合用于大批量生產(chǎn)。翌圣擁有雙向分子酶理性設(shè)計(jì)與定向進(jìn)化平臺(tái)和專門為GMP級(jí)別產(chǎn)品打造的分子酶生產(chǎn)基地，研發(fā)生產(chǎn)出純度高、消化活性強(qiáng)的GMP級(jí)別RNase R產(chǎn)品，為新一代RNA疫苗/藥物上市提供助力！
圖1：環(huán)狀RNA 生產(chǎn)流程圖
（來(lái)源：Front Immunol 2023 Jan 12:13:1091797. doi: 10.3389/fimmu.2022.1091797. eCollection 2022.）
RNase R（Ribonuclease R, RNase R）是一種來(lái)源于大腸桿菌的Mg2+依賴性3'→5'核糖核酸外切酶，它能消化所有的線性RNA，不易消化circRNA、套索RNA或3’端突出末端少于7 個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子。RNase R常用于去除線性RNA分子，實(shí)現(xiàn)富集circRNA和套索RNA等非線性RNA的目的。
主要應(yīng)用場(chǎng)景為：
1）基因表達(dá)研究；
2）可變剪切研究；
3）從生物樣本中富集 circRNA；
4）識(shí)別內(nèi)含子套索結(jié)構(gòu) RNA；
5）鑒定外顯子 circRNA。
產(chǎn)品特點(diǎn)
蛋白純度（SDS-PAGE）≥95%；
無(wú)核酸外切酶殘留；
與競(jìng)品相比，產(chǎn)品消化線性RNA能力相當(dāng)；
與競(jìng)品相比，產(chǎn)品對(duì)circRNA富集作用相當(dāng)。
性能展示
蛋白純度（SDS-PAGE）≥95%
圖2：蛋白純度檢測(cè)：從左到右依次為相同產(chǎn)品濃度下不同體積（1 μL，2 μL，3 μL）的結(jié)果，結(jié)果表明翌圣RNase R產(chǎn)品蛋白純度≥95%。
無(wú)核酸外切酶殘留
圖3：核酸外切酶殘留檢測(cè)：將20 U 翌圣RNase R加入到 0.5 μg λDNA- Hind Ⅲ digest中，于37℃孵育4小時(shí)，之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳 ，結(jié)果顯示DNA 條帶未發(fā)生變化，說(shuō)明翌圣RNase R產(chǎn)品無(wú)核酸外切酶殘留。
與A進(jìn)口品牌RNase R產(chǎn)品消化線性RNA能力相當(dāng)
圖4：翌圣RNase R產(chǎn)品與A進(jìn)口廠家RNase R產(chǎn)品消化線性RNA能力比較：將翌圣RNase R產(chǎn)品與A進(jìn)口廠家RNase R產(chǎn)品分別投入含有線性RNA底物的反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果顯示當(dāng)RNase R產(chǎn)品的投入量達(dá)到2-4 U時(shí)，可觀察到RNA條帶變微弱甚至消失，表明RNase R對(duì)線性RNA分子具有消化作用，且翌圣RNase R產(chǎn)品與A進(jìn)口廠家RNase R產(chǎn)品對(duì)線性RNA分子的消化能力相當(dāng)。
與A進(jìn)口品牌RNase R產(chǎn)品對(duì)circRNA富集作用相當(dāng)
圖5：翌圣RNase R產(chǎn)品與A進(jìn)口廠家RNase R產(chǎn)品對(duì)circRNA的富集作用比較：將翌圣產(chǎn)品與A進(jìn)口廠家RNase R產(chǎn)品分別投入含有circRNA底物的反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)翌圣RNase R產(chǎn)品與A進(jìn)口廠家RNase R產(chǎn)品處理后的RNA條帶亮度基本無(wú)差別，表明circRNA能耐受RNase R的消化。以上結(jié)果證實(shí)翌圣產(chǎn)品與A進(jìn)口廠家RNase R產(chǎn)品均能有效用于circRNA富集。
客戶反饋
翌圣RNase R對(duì)線性RNA的切割效果優(yōu)于其他品牌
圖6：翌圣產(chǎn)品與廠家A和B的RNase R消化線性mRNA分子效果比較：將翌圣RNase R產(chǎn)品與廠家A和B的RNase R產(chǎn)品分別投入含有1 μg 線性mRNA底物的反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果顯示翌圣RNase R產(chǎn)品對(duì)線性RNA的消化效果優(yōu)于廠家A和B的RNase R。
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品規(guī)格 |
RNase R (20 U/μL) | 14606ES | 250U/2500U/10000U |
RNase R GMP-grade (20 U/μL) | 14615ES | 500U/5000U/20KU/200KU |
10×RNase R Reaction Buffer GMP-grade | 14616ES | 500µl/1 mL/5 mL/10mL/100mL |
參考文獻(xiàn)
1.Qu L, Yi Z, Shen Y, et al. Circular RNA vaccines against SARS-CoV-2 and emerging variants. Cell. 2022;185(10):1728-1744.e16. doi:10.1016/j.cell.2022.03.044
2.Chen L, Wang C, Sun H, et al. The bioinformatics toolbox for circRNA discovery and analysis. Brief Bioinform. 2021;22(2):1706-1728. doi:10.1093/bib/bbaa001
