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成功進(jìn)化出兼具高熱穩(wěn)定、高建庫產(chǎn)量、低接頭自連的T4 DNA連接酶突變體

2024-9-20　　閱讀(84)

T4 DNA連接酶（T4 DNA Ligase）是一種由T4噬菌體編碼的酶，以ATP作為輔因子，催化雙鏈DNA或RNA的5’-磷酸與3’-羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶既能催化黏性末端分子間或平末端分子間的連接，也能修復(fù)雙鏈DNA或DNA-RNA雜交雙鏈上的單鏈DNA切口，廣泛用于NGS測序，分子克隆等應(yīng)用。然而，T4 DNA連接酶在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些挑戰(zhàn)，包括穩(wěn)定性差、接頭自連率高或DNA建庫產(chǎn)量低等問題。這些問題可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)效率的降低、數(shù)據(jù)質(zhì)量的下降、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性差以及產(chǎn)物純度低等，進(jìn)而影響分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的整體效果和測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。為了解決這些問題，翌圣鎂孚泰生物基于ZymeEditorTM創(chuàng)新型酶進(jìn)化平臺(tái)對(duì)T4 DNA連接酶進(jìn)行了酶改造。

圖1.T4 DNA 連接酶反應(yīng)原理

干濕實(shí)驗(yàn)交互篩選

獲得高性能T4 DNA連接酶

T4 DNA連接酶的結(jié)構(gòu)由緊密纏繞的DNA結(jié)合域（DBD）、核苷酸轉(zhuǎn)移酶（NTase）域以及OB折疊域構(gòu)成。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，對(duì)DNA底物周圍5至20埃范圍內(nèi)的氨基酸殘基進(jìn)行了模擬篩選和結(jié)構(gòu)-功能分析。分析結(jié)果揭示了T4 DNA連接酶中存在一個(gè)遠(yuǎn)離活性中心的柔性環(huán)。接著，基于能量計(jì)算，設(shè)計(jì)了對(duì)這個(gè)環(huán)區(qū)域的截?cái)唷Ｍ瑫r(shí)，通過對(duì)齊共識(shí)序列，并結(jié)合結(jié)構(gòu)與功能數(shù)據(jù)的綜合分析，精心設(shè)計(jì)突變體。

圖2.T4 DNA 連接酶

除了采用理性設(shè)計(jì)方法外，還通過微孔板篩選技術(shù)（MTPs）對(duì)T4 DNA連接酶進(jìn)行了定向進(jìn)化。篩選了超過10^4個(gè)突變體的庫后，成功獲得了具有更高穩(wěn)定性和更高活性的T4 DNA連接酶突變體。通過對(duì)大量突變體的數(shù)據(jù)分析，從中挑選出有潛力的候選突變體進(jìn)行純化，并準(zhǔn)備進(jìn)行后續(xù)測試。所有通過理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化獲得的突變體，在經(jīng)過精細(xì)純化后，都進(jìn)行了詳盡的表征分析。這包括對(duì)其活性、穩(wěn)定性、接頭自連接、DNA片段自連接以及DNA產(chǎn)量的評(píng)估，旨在開發(fā)出能夠滿足多樣化應(yīng)用需求的高性能突變體。

數(shù)據(jù)展示

更高的熱穩(wěn)定性

將翌圣鎂孚泰生物的T4 DNA連接酶突變體與供應(yīng)商Q、供應(yīng)商N(yùn)、供應(yīng)商A以及供應(yīng)商T的T4 DNA連接酶進(jìn)行42℃下0、2 、4 h的熱處理。接著，使用翌圣生物DNA建庫試劑盒（Cat#12927ES）、投入1 µg斷裂的牛gDNA來構(gòu)建全基因組DNA庫。

結(jié)果：

熱穩(wěn)定性分析：翌圣鎂孚泰生物≈供應(yīng)商N(yùn)≈供應(yīng)商A >供應(yīng)商T >供應(yīng)商Q。
建庫產(chǎn)量分析：翌圣鎂孚泰生物≈供應(yīng)商Q≈供應(yīng)商T >供應(yīng)商A >供應(yīng)商N(yùn)。

圖3.42℃熱穩(wěn)定性測試（Molefuture表示翌圣鎂孚泰的T4 DNA連接酶突變體，下同）

更高的建庫產(chǎn)量

將翌圣鎂孚泰生物的T4 DNA連接酶突變體與供應(yīng)商Q、供應(yīng)商N(yùn)、供應(yīng)商A以及供應(yīng)商T的T4 DNA連接酶進(jìn)行高低DNA投入量下的建庫產(chǎn)量對(duì)比測試，使用翌圣DNA建庫試劑盒（Cat#12927ES），分別投入1 µg、0.5 ng斷裂的牛gDNA來構(gòu)建DNA文庫。

結(jié)果：

1 µg gDNA投入量下的建庫產(chǎn)量分析：翌圣鎂孚泰生物>供應(yīng)商Q≈供應(yīng)商T≈供應(yīng)商A >供應(yīng)商N(yùn)。
0.5 µg gDNA投入量下的建庫產(chǎn)量分析：翌圣鎂孚泰生物≈供應(yīng)商Q≈供應(yīng)商A≈供應(yīng)商T >供應(yīng)商N(yùn)。

圖4.DNA建庫產(chǎn)量分析

更低的接頭自連

將翌圣鎂孚泰生物的T4 DNA連接酶突變體與供應(yīng)商Q、供應(yīng)商N(yùn)、供應(yīng)商A以及供應(yīng)商T的T4 DNA連接酶進(jìn)行接頭自連對(duì)比測試，使用翌圣DNA建庫試劑盒（Cat#12927ES），分別投入0 ng、0.5 ng斷裂的牛gDNA來構(gòu)建全基因組DNA文庫。

結(jié)果：

0 ng gDNA投入量下的接頭自連分析：供應(yīng)商N(yùn) > 翌圣鎂孚泰生物 > 供應(yīng)商T > 供應(yīng)商A > 供應(yīng)商Q。
0.5 ng gDNA投入量下的接頭自連分析：翌圣鎂孚泰生物 > 供應(yīng)商T > 供應(yīng)商Q ≈ 供應(yīng)商N(yùn) > 供應(yīng)商A。

圖5.投入0、0.5 ng gDNA的接頭自連數(shù)據(jù)

T4 DNA ligase突變體訂購指南

這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證實(shí)了翌圣鎂孚泰生物改良后的T4 DNA連接酶在熱穩(wěn)定性、建庫產(chǎn)量和接頭自連方面均表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。目前改良后的T4 DNA連接酶—Hieff® Versatile T4 DNA Ligase (600 U/μL) （Cat#12996ES）已成功上市，這款產(chǎn)品在連接效率和熱穩(wěn)定性上均優(yōu)于傳統(tǒng)野生型T4 DNA Ligase，可催化黏性末端或平末端分子間的連接反應(yīng)，用于NGS建庫中的DNA片段與接頭連接。該產(chǎn)品已經(jīng)過高通量測序驗(yàn)證，質(zhì)量優(yōu)異，貨架期更持久！如果您對(duì)產(chǎn)品感興趣，歡迎掃描下方二維碼進(jìn)行產(chǎn)品訂購與咨詢！翌圣鎂孚泰生物以酶進(jìn)化技術(shù)為驅(qū)動(dòng)，專注于提供酶改造定制化解決方案。若有其他酶改造需求，也可以通過下方二維碼隨時(shí)聯(lián)系我們哦！