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2024年，諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予了維克托·安布羅斯（Victor Ambros）和加里·魯夫昆（Gary Ruvkun）這兩位美國科學家，以表彰他們在微小RNA（microRNA）及其在轉錄后基因調控中的關鍵作用方面的突破性發(fā)現(xiàn)。這一發(fā)現(xiàn)揭示了基因調控的新原理，并對生物體的發(fā)育和功能有著根本性的重要作用。
安布羅斯和魯夫昆的工作證明了microRNA在轉錄后基因調控中的作用，這是一種全新的基因調控機制。在此之前，科學界的焦點主要集中在轉錄因子如何作用于DNA，從而決定哪些mRNA被合成，進而控制遺傳信息的傳遞。然而，這兩位科學家的發(fā)現(xiàn)刷新了我們對基因調控的理解，揭示了microRNA在調節(jié)基因表達中的重要性。研究顯示，人類基因組中編碼了超過1000個的microRNA，這些microRNA在生物界中普遍存在，并在維持基因平衡和細胞功能方面發(fā)揮著重要的作用。
microRNA是一類長度約為 22 個核苷酸的小型 RNA，大多數(shù) miRNA 來自非編碼 RNA 或內含子，很少有與編碼基因外顯子重疊，保守的 miRNA (即在脊椎動物中共享) 主要通過經典的 miRNA 途徑生成，該途徑涉及兩個 RNase III 酶：Drosha 和 Dicer。
Drosha 在細胞核中剪切 pri-miRNA 的發(fā)夾結構，釋放出前 miRNA (pre-miRNA)。
pre-miRNA 被轉運到細胞質中，由 Dicer 在末端環(huán)附近剪切，產生 miRNA 雙鏈。
成熟的 miRNA 一條鏈（miRNA*）被丟棄，另一條鏈（成熟 miRNA）與 Argonaute (Ago) 蛋白結合，并指導 Ago 復合物沉默互補的 RNA 目標。
除了經典的 Drosha/Dicer 途徑，還存在一些非經典的 miRNA 途徑，這些途徑不依賴于 Drosha 或 Dicer。例如：
mirtrons: 由內含子剪接機制和內含子去分支酶生成的 pre-miRNA 類似物，從而繞過 Drosha。
tRNA-miRNA: 通過 RNase Z 的作用生成功能性 pre-miRNA。
5’-帽化的發(fā)夾結構: 由 RNA 聚合酶 II 轉錄，并帶有 5’ 帽子，然后由 XPO1 轉運到細胞質中。Dicer 只剪切帶有帽子的 pre-miRNA 的 3’ 臂，從而產生成熟的 miRNA。
圖.miRNA合成示意圖[1]
microRNA研究涉及多個層面，從發(fā)現(xiàn)和驗證新的microRNA分子，到理解它們的功能和機制，再到可能的治療應用。以下是一些microRNA研究中的常見問題和相應的解決方案：
發(fā)現(xiàn)和驗證新的microRNA-如何從復雜的RNA樣本中鑒定出新的microRNA？
高通量測序：使用高通量測序技術（如RNA-seq）來鑒定新的microRNA分子。
生物信息學分析：利用專門的軟件工具對測序數(shù)據(jù)進行處理，預測microRNA的序列和結構。
實驗驗證：通過Northern blotting、RT-qPCR等方法驗證預測的microRNA的存在和表達水平。
理解microRNA的功能-如何確定特定microRNA的功能？
功能喪失實驗：通過敲減或敲除特定microRNA，觀察細胞或模型生物表型的變化。
靶基因預測：使用生物信息學工具預測microRNA的靶基因，并通過實驗驗證這些靶基因。
報告基因系統(tǒng)：使用含有microRNA反應元件的報告基因系統(tǒng)來測試microRNA對基因表達的調控。
microRNA的機制研究-如何探究microRNA如何調控基因表達？
蛋白質組學分析：使用質譜等技術分析microRNA調控下的蛋白質表達變化。
免疫共沉淀：研究microRNA與RNA誘導沉默復合體（RISC）的相互作用。
細胞成像技術：利用熒光顯微鏡等觀察microRNA在細胞內的分布和動態(tài)。
microRNA在疾病中的作用-如何研究microRNA在疾病中的作用？
疾病模型：在動物模型中研究特定microRNA的缺失或過表達對疾病進展的影響。
臨床樣本分析：收集和分析疾病狀態(tài)下microRNA的表達譜，尋找潛在的生物標志物。
藥物干預：開發(fā)microRNA靶向藥物，如antagomirs、miRNA mimics等，用于治療研究。
microRNA的治療應用-如何將microRNA研究轉化為臨床治療？
藥物設計：設計能夠特異性結合和抑制或激活特定microRNA的藥物。
臨床前研究：在細胞和動物模型中測試藥物的安全性和有效性。
臨床試驗：開展臨床試驗以評估m(xù)icroRNA靶向治療的安全性和療效。
產品推薦
目前定量分析miRNA的方法中最為常用的是熒光定量PCR。但是miRNA本身相對較小，傳統(tǒng)的RNA提取、反轉錄和定量方法難以高效的保證miRNA的檢測，選對適配的方法此時則顯得尤為重要。
傳統(tǒng)的有機提取通常提取的是較大分子量的RNA，例如mRNA和核糖體RNA，但對于miRNA的提取效果則不太理想，可能是由于小分子量的miRNA不易被醇類沉淀。針對這個問題，翌圣匠心研發(fā)了專門針對miRNA提取的產品-MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit 細胞/組織miRNA提取試劑盒。
19331ES-MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit 細胞/組織miRNA提取試劑盒
采用MolPure® RNA Column M1和microRNA Column M1以及新型的溶液體系，適用于從多種新鮮或凍存的動物組織或培養(yǎng)細胞中快速提取各種小RNA。試劑盒內的MolPure® RNA Column M1可選擇性吸附核酸，不吸附蛋白質、多糖和其它非核酸類物質；microRNA Column M1則能從總RNA中有效富集到15-30 nt左右的小RNA（包括siRNA和miRNA）。
產品性能
成熟的miRNA的長度只有20nt左右，通常正向引物就會覆蓋其全長甚至會有多余部分，反向引物就無處安置了。目前市面上解決方案就是在反轉錄時設法增加反轉錄產物長度。常見的方法有加尾法和莖環(huán)法。
加尾法利用PolyA 聚合酶為成熟的miRNA加上Poly(A)尾，以帶有通用序列的Oligo-dT作為反轉錄引物，合成加長的miRNA對應cDNA第一鏈。莖環(huán)法以折疊為莖環(huán)結構的通用序列作為引物合成加長的miRNA對應cDNA第一鏈，后續(xù)擴增過程中，莖環(huán)結構在適宜的溫度下會被打開，和相關擴增引物結合。
圖. 加尾法合成miRNA
圖.莖環(huán)法合成miRNA
類別 | 加尾法 | 莖環(huán)法 |
適用性 | 適合于同時研究多種不同miRNA的情況 | 適合對樣本中少量幾個miRNA的精確定量檢測 |
優(yōu)點 | 一次反轉錄可檢測多個miRNA，通量高 | 一次反轉錄只能檢測一個miRNA，特異性強 |
反轉錄體系 | 內參與miRNA一起，在同一個反應體系反轉錄，準確性高 | 內參與miRNA分開，在兩個體系分別反轉錄，容易產生誤差 |
檢測特異性 | ★★★★☆ | ★★★★★ |
檢測靈敏度 | ★★★★★ | ★★★★☆ |
實驗時間 | ★★★★☆ | ★★★★★ |
翌圣miRNA加尾法反轉定量組合（11148ES&11171ES)
11148ES-Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit
試劑盒采用加尾法來進行miRNA第一鏈cDNA的反轉錄，產品中的2×Hifair® miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反應和反轉錄反應的所有原料和引物，并經過精心優(yōu)化，可保證miRNA 3‘末端的Poly(A)修飾過程和反轉錄過程同時高效進行。
11171ES -Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix
專門為miRNA定量檢測而研發(fā)的新一代預混形式的熒光定量PCR檢測試劑，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適用于所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調整ROX的濃度，只需在配制反應體系時加入引物和模板即可進行擴增。DNA 聚合酶采用化學修飾的熱啟動聚合酶，配合特殊的Buffer體系，使反應特異性更好，靈敏度更高，并能在更廣的范圍內進行準確定量。
產品性能
圖. 以293T細胞的Total RNA為模板，用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進行反轉錄，獲得的cDNA稀釋10倍后，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分別檢測hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、U6內參基因。
圖. 以人工合成hsa-miR-let-7e-5p(a)和293T細胞Total RNA(b)為模板，分別稀釋成以下梯度：60拷貝到606拷貝（6個梯度）和10 pg-100 ng(5個梯度)，用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進行反轉錄，獲得的cDNA用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)檢測hsa-miR-let-7e-5p基因表達情況。
圖. 人類hsa-let-7家族擁有多條miRNA，彼此間相差的堿基很少，甚至只有單堿基的差異。每個Let-7亞型（hsa-miR-let-7a~Let-7i，has-miR-98）的人工合成miRNA使用 Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進行反轉錄合成cDNA，以不用的引物，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分別擴增這些miRNA，利用公式2-ΔCT x 100%計算匹配率。結果顯示，可有效區(qū)分密切相關的亞型家族成員。
圖. 以人293T細胞和鼠源肝臟Total RNA為模板，擴增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因。結果顯示，與同類產品相比，Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)配套 Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)的反應體系，具有優(yōu)異的表現(xiàn)。
翌圣miRNA莖環(huán)法反轉定量組合（11139ES&11170ES)
11139ES-Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)
該試劑盒基于Hifair® III Reverse Transcriptase而開發(fā)。該酶cDNA合成速度快，且熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受高達60℃的反應溫度，適合具有復雜二級結構的RNA模板的反轉錄。同時，該酶增強了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的反轉錄。Hifair® III Reverse Transcriptase合成全長cDNA的能力也有了提升，可合成長達19.8 kb的cDNA。
11170ES-Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix
本產品是使用SYBR Green I嵌合熒光法進行miRNA定量反應的專用預混液。由于miRNA序列短，且同一家族的miRNA序列往往高度相近，故在定量時對特異性要求高。本品基于熱啟動的 DNA 聚合酶，配以優(yōu)化的Buffer，能夠極大地減少非特異性擴增；同時，特殊的ROX Reference Dye，使得預混液適應于所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調整ROX濃度，只需在配制反應體系時加入引物和模板即可進行擴增。
圖.以小鼠肝臟細胞的Total RNA為模板，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進行反轉錄，獲得的cDNA稀釋40倍后，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分別擴增人源的mmu-miR-125a基因。
圖.以小鼠肝臟細胞的Total RNA為模板，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進行反轉錄，獲得的cDNA 以10倍梯度稀釋（范圍10pg /μL-0.1μg /μL），擴增鼠源的mmu-miR-125a、mmu-miR-132、mmu-miR-351基因。
圖. 人類hsa-let-7家族擁有多條miRNA，彼此間相差的堿基很少，甚至只有單堿基的差異。以不同的引物，使用 Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分別擴增這些miRNA，利用公式2^-△ct x 100%計算匹配率。
圖.以人293T細胞的Total RNA為模板反轉錄，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進行反轉錄，獲得的cDNA稀釋50倍，使用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）進行90孔平行重復實驗擴增人源的hsa-let-7a基因。
相關產品列表
方法類型 | 實驗步驟 | 產品名稱 | 產品貨號 |
miRNA轉染 | 細胞轉染 | Hieff Trans® in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent | 40806ES |
miRNA提取 | 核酸提取 | MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit | 19331ES |
MolPure® Serum/Plasma miRNA Kit | 19332ES | ||
加尾法反轉定量 | 反轉錄 | Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11148ES |
定量PCR | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix | 11171ES | |
莖環(huán)法反轉定量 | 反轉錄 | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) | 11139ES |
定量PCR | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix | 11170ES |
[1] Shang R, Lee S, Senavirathne G, Lai EC. microRNAs in action: biogenesis, function and regulation. Nat Rev Genet. 2023;24(12):816-833. doi:10.1038/s41576-023-00611-y
