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產(chǎn)品描述

JC-10線粒體膜電位熒光探針試劑盒是JC-1的升級產(chǎn)品，同樣可用于檢測線粒體膜電位的變化。因JC-1雖然在許多實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用，但是其水溶性很差，即使在1 μM濃度的條件下，JC-1也會在水的緩沖液中析出。而JC-10具有更好的水溶性，可以在某些需要高濃度染料的實(shí)驗(yàn)中替代JC-1。雖然在一些細(xì)胞系中JC-10有著比JC-1更好的表現(xiàn)，不過，JC-10的性能表現(xiàn)具細(xì)胞依賴性特征。

正常細(xì)胞內(nèi)，JC-10選擇性聚集在線粒體基質(zhì)中形成可逆的紅色熒光聚合物（Ex=540 nm, Em=590 nm）；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，JC-10由多聚體轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w形式存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光（Ex=490 nm, Em=525 nm）。JC-10不僅可用于定性檢測，因顏色的變化可以非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。也可以用于定量檢測，因線粒體的去極化程度可以通過紅/綠熒光強(qiáng)度的比例來衡量。這兩種顏色的變化可以用流式細(xì)胞儀上的標(biāo)準(zhǔn)濾光器檢測到，綠色熒光可用FL1通道分析，紅色熒光可用FL2通道分析。除了用于流式細(xì)胞術(shù)，也可以用于熒光成像和熒光酶標(biāo)板檢測平臺。

本試劑盒中提供了陽性對照CCCP，其能誘導(dǎo)線粒體膜電位下降。對于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測100個(gè)樣品。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。-20℃干燥避光保存，分裝，以避免反復(fù)凍融，一年有效。超純水和JC-10染色緩沖液（5×）也可4℃保存。

注意事項(xiàng)

1）JC-10（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
2）須把JC-10（200×）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后才可加入JC-10染色緩沖液（5×）。不可先配制JC-10染色緩沖液（1×）再加入JC-10（200×），否則JC-10將很難充分溶解并會嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測使用。

3）使JC-10染色緩沖液（1×）保持4℃左右，此時(shí)的洗滌效果較好。

4）JC-10探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測過程。在檢測前需冰浴保存。
5）請勿把JC-10染色緩沖液（5×）全部配制成JC-10染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-10染色緩沖液（5×）。

6）如果發(fā)現(xiàn)JC-10染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在37℃加熱。

7）CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護(hù)。

8）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
9）本產(chǎn)品僅作科研用途！

使用方法

1. JC-10染色工作液的配置

 取適量JC-10（200×），按照每50 μL JC-10（200×）加入8 mL超純水的比例稀釋，劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-10，然后再加入2 mL JC-10染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-10染色工作液。

2. 陽性對照的設(shè)置

取出試劑盒中供的CCCP（10 mM）按照1∶1000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，使其終濃度為10 μM，處理細(xì)胞20分鐘。隨后按照下述方法裝載JC-10，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測。對于大多數(shù)細(xì)胞，通常10 μM CCCP處理20分鐘后線粒體的膜電位會喪失，JC-10染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng)JC-10染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對于特定的細(xì)胞，CCCP的作用濃度和作用時(shí)間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料決定。

3. 細(xì)胞染色

3.1對于懸浮細(xì)胞

1）取1×105～6×105個(gè)細(xì)胞重懸于0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中（可以含血清和酚紅），加入0.5 mL JC-10染色工作液，顛倒混勻。
2）37℃孵育20分鐘。孵育期間，按每1 mL JC-10染色緩沖液（5×）加入4 mL蒸餾水的比例配制適量的JC-10染色緩沖液（1×），并置于冰浴，作為洗液。
3）37℃孵育結(jié)束后，600g  4℃離心3～4分鐘，棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。加入1 mL JC-10染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600 g， 4℃離心3～4分鐘，棄上清，重復(fù)一次。
4）用適量JC-10染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計(jì)檢測或流式細(xì)胞儀分析。

3.2對于貼壁細(xì)胞

1）對于6孔板，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可用PBS或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液（可

以含血清和酚紅）。
2）然后加入1 mL JC-10染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。孵育期間，按每1 mL JC-10染色緩沖液（5×）加入4 mL蒸餾水的比例配制適量的JC-10染色緩沖液（1×），并放置于冰浴，作為洗液。

3）37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-10染色緩沖液（1×）洗滌2次。

4）加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。
注：對于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測，可以先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法。

3.3對于純化的線粒體
1）把配制好的JC-10染色工作液用JC-10染色緩沖液（1×）稀釋5倍。取5倍稀釋的JC-10染色工作液0.9 mL 加入0.1 mL總蛋白量為10～100 μg純化的線粒體。
2）用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時(shí)間掃描（time scan），激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為590 nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長不能設(shè)置為485nm時(shí)，可以在475～520nm范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。

4. 熒光觀測

檢測JC-10單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為490 nm，發(fā)射光設(shè)置為530 nm；檢測JC-10聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設(shè)置為525 nm，發(fā)射光設(shè)置為590 nm。

注：此處測定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測JC-10單體時(shí)可以參考觀察其它綠色熒光時(shí)的設(shè)置，如觀察GFP或FITC時(shí)的設(shè)置；檢測JC-10聚合物時(shí)可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3時(shí)的設(shè)置。