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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

鱟試劑（ Limulus amebocyte lysate, LAL）為鱟科動(dòng)物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的冷凍干燥品，鱟試劑中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。

本試劑盒的檢測(cè)原理是：在適宜的條件下（溫度，pH值及無干擾物質(zhì)），細(xì)菌內(nèi)毒素激活C因子，引起一系列酶促反應(yīng)，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的顯色基質(zhì)，使其分解為多肽和黃色的對(duì)硝基苯胺（pNA，λmax = 405 nm）。在一定時(shí)間內(nèi)，pNA的生成量與細(xì)菌內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)，據(jù)此，可以定量供試品的內(nèi)毒素濃度。同時(shí)，對(duì)硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化試劑染成玫瑰紅色（λmax = 545 nm），避免了供試品本身的顏色對(duì)405nm處吸收峰的干擾。

按反應(yīng)時(shí)間不同可檢測(cè)0.1 EU/mL-1 EU/mL 和0.01 EU/mL -0.1 EU/mL 兩個(gè)區(qū)間（反應(yīng)時(shí)間T1和T2見出廠檢驗(yàn)報(bào)告） 。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。4 oC，避光保存，有效期2年。

需準(zhǔn)備的材料和設(shè)備注意事項(xiàng)

1）該試劑盒用于體外細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測(cè)，嚴(yán)禁試劑以任何途徑進(jìn)入機(jī)體。
2）接觸試劑及供試品的所有器皿必須是除熱原的， 玻璃器皿可經(jīng)250℃干烤至少60 min去除熱原。試驗(yàn)過程應(yīng)防止微生物的污染。
3）當(dāng)供試品中可能存在鱟試驗(yàn)的干擾物質(zhì)時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)，參見供試品的干擾試驗(yàn)。

4）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

5）本品僅用于科研用途。

無熱原試管、無熱原吸頭，濃鹽酸。漩渦混合儀、移液器、多道移液器、封口膜、試管架。恒溫水浴箱（37±1℃）、分光光度計(jì)。

供試品的貯存與預(yù)處理（若供試品為血液類，請(qǐng)參照我司配套血液相關(guān)處理試劑使用說明書）

1）供試品的pH值應(yīng)在6-8之間，若超出此范圍，需用無熱原緩沖液、0.1 M氫氧化鈉或0.1 M鹽酸調(diào)節(jié)。

2）若供試品中可能存在鱟實(shí)驗(yàn)的干擾物質(zhì)，處理參見供試品的干擾試驗(yàn)。
3）若供試品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖會(huì)產(chǎn)生G因子旁路反應(yīng)，干擾內(nèi)毒素檢測(cè)），需選用特異性鱟試劑。
4）若供試品為一些抗菌素如頭孢類抗菌素和磺胺制劑會(huì)對(duì)偶氮染色劑產(chǎn)生偶聯(lián)反應(yīng)而干擾偶氮化顯色，需要選用不含偶氮化試劑的試劑盒（我公司提供）。

5）若供試品的本底吸光度值大于0.5，必須對(duì)供試品進(jìn)行稀釋后再檢測(cè)。

6）若供試品顏色較深（例如溶血），或在酸性條件下顏色加深（例如一些組織培養(yǎng)介質(zhì)），必須設(shè)置供試品空白管以扣除供試品自身的顏色本底。供試品空白管不加入鱟試劑，以等體積鱟試劑的溶劑（該處為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水）代替。其余操作同供試品管。

操作方法

1.細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
1）溶解：取細(xì)菌內(nèi)毒素工作品1支，加入1 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水），置漩渦混勻器上混勻15 min，混勻時(shí)要防止液體濺出。

2）稀釋：將細(xì)菌內(nèi)毒素母液先用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成1 EU/mL，再稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。 

A. 以10 EU/mL的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和0.5、0.25、0.125、0.0625 EU/mL的梯度為例說明：

在10 EU/支的工作標(biāo)準(zhǔn)品中加入1 mL BET水，則標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10 EU/mL。取0.2 mL 10 EU/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，加入1.8 mL BET水， 終濃度為1.0 EU/mL。以此為母液按下表稀釋成等比例濃度梯度。配制好的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)在4 h內(nèi)用完。

注：每步稀釋均需在漩渦混勻器上混勻30 sec。

表1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

B. 其余梯度濃度視情況而定。

2.陰性對(duì)照：為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。

3.終止劑的配置：取50 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，加入2 mL濃鹽酸，搖勻即可。或取10 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，加入0.4 mL濃鹽酸，搖勻即可。

4.鱟試劑、顯色基質(zhì)、偶氮化試劑等的溶解
1）鱟試劑：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于鱟試劑中，輕輕振搖使鱟試劑*溶解，注意不要用旋渦混勻儀激烈振搖。溶解的鱟試劑應(yīng)在10 min內(nèi)用完。
2）顯色基質(zhì)：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于顯色基質(zhì)中，輕輕振搖使顯色基質(zhì)*溶解。顯色基質(zhì)溶液可在無污染的條件下于4oC貯存8 h以內(nèi)。

3）偶氮化試劑1：按標(biāo)示量加反應(yīng)終止劑HCl于偶氮化試劑1中；

4）偶氮化試劑2：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑2中；

5）偶氮化試劑3：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑3中；

6）偶氮化試劑溶液可于4oC貯存1周。

5.實(shí)驗(yàn)操作

1）取無熱原試管，加入100 μL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，或供試品。

2）再加入100 μL鱟試劑溶液，混勻，37oC溫育T1 min。

3）溫育結(jié)束，加入100 μL 顯色基質(zhì)溶液，混勻，37oC溫育T2 min。

4）溫育結(jié)束，加入500 μL 偶氮化試劑1溶液，混勻。

5）加入500 μL偶氮化試劑2溶液，混勻。

6）加入500 μL偶氮化試劑3溶液，混勻，靜置5 min，于545 nm波長處讀取吸光度值。(見表2)

表2 實(shí)驗(yàn)操作

（上述T1及T2見該批鱟試劑的出廠檢驗(yàn)報(bào)告)

數(shù)據(jù)處理

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y = b X + a，

其中Y為545 nm處吸光度值，X為內(nèi)毒素的濃度，b為直線斜率，a為Y軸截距。

當(dāng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同時(shí)滿足如下三個(gè)條件時(shí)實(shí)驗(yàn)才有效：

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù) r ≥ 0.980；

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線低點(diǎn)的Y值大于陰性對(duì)照的Y值；

3）供試品平行管的平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的區(qū)間內(nèi)。

供試品的干擾試驗(yàn)

供試品的干擾試驗(yàn)詳見《中華人民共和國藥典》2010版中《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》的“光度測(cè)定法干擾試驗(yàn)"。當(dāng)鱟試劑、供試品的來源、配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。步驟如下：
1）選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（設(shè)為λm），作為供試品干擾試驗(yàn)中添加的內(nèi)毒素濃度，配制含λm內(nèi)毒素的供試品陽性對(duì)照，測(cè)量出該溶液的內(nèi)毒素濃度，稱為Cs；

2）測(cè)量出未添加外源內(nèi)毒素的供試品溶液內(nèi)毒素濃度,稱為Ct；

3）計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率R＝（Cs–Ct）/λm×100%

4）當(dāng)R在50%～200%之間，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。
5）當(dāng)R在50%～200%之外，需對(duì)供試品進(jìn)行系列稀釋(稀釋倍數(shù)不得超過大有效稀釋倍數(shù)MVD)或進(jìn)行其它處理消除干擾,每一稀釋溶液都重復(fù)步驟1-3，直到內(nèi)毒素的回收率R在50%～200%之間。選擇回收率R接近100%的稀釋倍數(shù)進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)。

HB220223