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Hieff Clone^TM One Step Cloning Kit 一步法快速克隆試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff Clone^TM One Step Cloning Kit是一款簡單、快速、高效的DNA定向克隆產(chǎn)品，該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)，可高效克隆50 bp～10 kp片段。將載體在克隆位點(diǎn)進(jìn)行線性化，并在插入片段PCR引物5’端引入線性化克隆載體末端序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’zui末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應(yīng)的**的序列 (15 bp～20 bp)。將這種兩端帶有載體末端序列的PCR產(chǎn)物和線性化克隆載體按一定比例混合，在重組酶Exnase的催化下，僅需反應(yīng)30 min即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆?？寺￡栃月士蛇_(dá)95%以上?？寺≥d體酶切產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物和插入片段PCR產(chǎn)物可以不進(jìn)行DNA純化直接用于重組克隆，極大的簡化了實(shí)驗步驟。

試劑盒中包含有重組反應(yīng)所需緩沖液和重組酶Exnase。Exnase中添加了*的重組增強(qiáng)因子，顯著提高重組克隆效率，即便使用低效率感受態(tài)細(xì)胞 (10⁷cfu/μg)也可實(shí)現(xiàn)高效克隆 (100cfu/ng Vector)，而且Exnase還兼容常規(guī)酶切、PCR反應(yīng)體系。

該試劑盒可用于快速克隆、高通量克隆、無縫克隆和DNA定點(diǎn)突變。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。產(chǎn)品-20 oC保存。

實(shí)驗流程

實(shí)驗流程概覽

1)        線性化克隆載體制備；

2)        插入片段擴(kuò)增引物設(shè)計；

3)        插入片段PCR擴(kuò)增；

4)        進(jìn)行重組反應(yīng)；

5)        反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板；

1. 克隆鑒定。

圖一 實(shí)驗流程概覽

1. 制備線性化克隆載體

選擇合適的克隆位點(diǎn)，并對克隆載體進(jìn)行線性化。推薦您盡量選擇無重復(fù)序列且GC含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆。當(dāng)載體克隆位點(diǎn)上下游20 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%～60%范圍之內(nèi)時，重組效率將達(dá)到zui大。

線性化載體可通過限制性內(nèi)切酶酶切（單酶切或雙酶切）或反向PCR擴(kuò)增獲得。

A．酶切制備線性化克隆載體

雙酶切線性化：線性化*，轉(zhuǎn)化背景 (假陽性克隆) 低。推薦使用。

單酶切線性化：線性化程度較差?？蛇m當(dāng)延長酶切時間以降低轉(zhuǎn)化背景。

注：1）Hieff Clone^TM重組反應(yīng)體系內(nèi)無DNA連接酶，不會發(fā)生載體自連反應(yīng)。因此，即使是以單酶切方式制備的線性化載體也無需進(jìn)行末端脫磷酸處理。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)的假陽性克隆 (無插入片段) 是由未線性化環(huán)狀載體轉(zhuǎn)化而形成的。如這種假陽性克隆比例較高，應(yīng)重新制備線性化克隆載體。

2）Hieff Clone^TM重組反應(yīng)體系兼容幾乎所有的酶切反應(yīng)體系?？寺≥d體酶切產(chǎn)物加熱失活內(nèi)切酶(參見內(nèi)切酶使用說明書，例如Hind III，65℃孵育20 min*失活)后可直接用于重組反應(yīng)。

B．反向PCR擴(kuò)增制備線性化克隆載體

推薦您使用高保真聚合酶進(jìn)行載體擴(kuò)增 (Hieff^TM Pfu DNA Polymerase， Cat No. 10113ES60) 以減少擴(kuò)增突變的引入。PCR擴(kuò)增模板應(yīng)盡量使用預(yù)線性化質(zhì)粒，以防止殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板對克隆陽性率的影響。

Hieff Clone^TM重組反應(yīng)體系兼容常規(guī)PCR反應(yīng)體系。因此，如擴(kuò)增模板為預(yù)線性化質(zhì)粒且PCR產(chǎn)物電泳條帶單一，擴(kuò)增產(chǎn)物可以無需純化直接用于重組反應(yīng)。

克隆載體酶切產(chǎn)物或PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物DNA 純度較低且有可能含有未線性化環(huán)狀質(zhì)粒，直接使用進(jìn)行重組反應(yīng)時，重組效率、克隆陽性率都會有所降低。因此，在進(jìn)行較大片段(>5kb) 克隆時，我們推薦您使用高質(zhì)量的試劑盒對線性化克隆載體進(jìn)行膠回收純化，以提高DNA 純度并去除一部分未線性化的環(huán)狀載體 (其電泳位置不同于線性化克隆載體)。不同方式制備的線性化克隆載體的使用方式可查閱表一。

表一：線性化克隆載體的使用方式

注：直接使用酶切產(chǎn)物或擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)時，使用體積不應(yīng)超過4μl（重組反應(yīng)總體積的1/5）

1. 制備PCR產(chǎn)物

2.1設(shè)計擴(kuò)增引物

Hieff Clone^TM引物設(shè)計總的原則是：通過在引物5’端引入線性化克隆載體末端同源序列，使得插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物5’和3’zui末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應(yīng)的**的序列 (15 bp～20 bp)。

正向擴(kuò)增引物設(shè)計方式：

5’——上游載體末端同源序列+基因特異性正向擴(kuò)增序列——3’

反向擴(kuò)增引物設(shè)計方式：

3’——基因特異性反向擴(kuò)增序列+下游載體末端同源序列——5’

基因特異性正/反向擴(kuò)增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴(kuò)增引物序列；

上游/下游載體末端同源序列為線性化克隆載體zui末端序列（用于同源重組）。

以pUC18作為克隆載體為例，引物設(shè)計方案如圖二所示。

圖二 重組引物設(shè)計方案

注：如zui終引物長度超過40bp，我們推薦您在引物合成時選用PAGE純化，可提高克隆成功率。計算擴(kuò)增引物退火溫度時，只需計算基因特異性擴(kuò)增序列的Tm值，載體末端同源序列不應(yīng)參與計算。

2.2 插入片段PCR擴(kuò)增

插入片段可用任意PCR酶 (Taq酶或高保真酶) 擴(kuò)增，無需考慮產(chǎn)物末端有無A加尾 (重組過程中將被去除，在zui終載體中不會出現(xiàn))。我們推薦您使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增(Hieff^TM Pfu DNA Polymerase， Cat No. 10113ES60)，以減少擴(kuò)增突變的引入。

PCR結(jié)束后，取少量產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳以檢驗擴(kuò)增產(chǎn)量和特異性。Hieff Clone^TM重組反應(yīng)體系兼容常規(guī)PCR反應(yīng)體系。因此，如擴(kuò)增模板不是與克隆載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒，且PCR產(chǎn)物電泳條帶單一，擴(kuò)增產(chǎn)物可以無需純化直接用于重組反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA純度較低，直接使用進(jìn)行重組反應(yīng)時，重組效率、克隆陽性率都會有所降低。因此，在進(jìn)行較大片段 (>5 kb) 克隆實(shí)驗時，我們推薦您使用高質(zhì)量的試劑盒對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化以提高DNA純度。插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用方式可查閱表二。

表二：擴(kuò)增產(chǎn)物推薦使用方式

注：直接使用擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)時，使用體積不應(yīng)超過4μl（重組反應(yīng)總體積的1/5）

*當(dāng)線性化克隆載體為酶切制備時，插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化結(jié)束后應(yīng)置于85℃加熱20 min將DpnI 失活，以避免重組反應(yīng)時殘留DpnI 對克隆載體的降解。

1. 重組反應(yīng)

3.1 配制反應(yīng)體系

于冰水浴中配制如下反應(yīng)體系。如果不慎將液體粘在管壁，可通過短暫離心使其沉入管底。

Hieff Clone^TM重組反應(yīng)體系zui適克隆載體使用量為0.03 pmol；zui適克隆載體與插入片段摩爾比為1:2，即zui適插入片段使用量為0.06 pmol。這些摩爾數(shù)對應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式粗略計算獲得：

zui適克隆載體使用量 = [0.02×克隆載體堿基對數(shù)]ng (0.03 pmol)

zui適插入片段使用量 = [0.04×插入片段堿基對數(shù)]ng (0.06 pmol)

例如，將長度為2 kb的插入片段克隆至長度為5 kb的克隆載體時，克隆載體的zui適使用量應(yīng)為：0.02 × 5000 = 100 ng; 插入片段zui適使用量應(yīng)為：0.04 × 2000 = 80 ng。

注：1) 當(dāng)插入片段長度大于克隆載體時，zui適克隆載體與插入片段使用量的計算方式應(yīng)互換，即將插入片段當(dāng)做克隆載體/克隆載體當(dāng)做插入片段進(jìn)行計算。

2) 線性化克隆載體的使用量應(yīng)在50～200 ng之間；插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用量應(yīng)在20～200 ng之間。當(dāng)使用上述公式計算DNAzui適使用量超出這個范圍時，直接選擇zui低/zui高使用量即可。例如，插入片段長度為100 bp，zui適使用量計算值為 4 ng，實(shí)際反應(yīng)體系內(nèi)使用量應(yīng)為插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物zui少使用量 20 ng。

3) 線性化克隆載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物不進(jìn)行DNA純化直接使用時，加入總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，即4 μl。

4) 試劑盒中提供500 bp control insert (25 ng/μl) 和pUC19control vector, linearized (50 ng/μl) 各5 μl，需要時可進(jìn)行陽性對照反應(yīng)，每次反應(yīng)各加1 μl。

3.2 重組反應(yīng)

1)         體系配制完成后，用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分，避免產(chǎn)生氣泡 (請勿劇烈震蕩或者渦旋混勻) 。

2)         置于37℃反應(yīng)30 min。

3)         待反應(yīng)完成后，立即將反應(yīng)管置于冰水浴中冷卻5 min。

4)         反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化；也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉(zhuǎn)化。

注：我們推薦您在PCR儀或者水浴鍋等溫控比較精確的儀器上進(jìn)行反應(yīng)。重組效率在反應(yīng)30 min左右達(dá)到zui高，反應(yīng)時間不足或者太長都將會降低克隆效率。

4.        重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板

1)         取20 μl冷卻反應(yīng)液，加入到200 μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。

2)         42℃熱激45～90秒，冰水浴孵育2 min。

3)         加入900 μl SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育10 min充分復(fù)蘇。37℃搖菌45 min。

4)         取100 μl菌液均勻涂布在含有適當(dāng)抗生素的平板上。將平板倒置，于37℃24H培養(yǎng)。

注：我們推薦您使用轉(zhuǎn)化效率>10⁸ cfu/μg的感受態(tài)細(xì)胞。如果感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率<10⁸ cfu/μg(例如用CaCl₂法新鮮制備的感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率通常在10⁶-10⁷ cfu/μg之間) ，請將培養(yǎng)菌液在5000 rpm離心3 min收集菌體，用100 μl LB培養(yǎng)基重懸后全部涂板。

5.        克隆鑒定

zui方便快捷的方法是菌落PCR。用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至20～50 μl LB 培養(yǎng)基中混勻，直接取1 μl作為PCR模板。

我們推薦您至少用一條通用測序引物進(jìn)行菌落PCR，這樣可以避免PCR假陽性的產(chǎn)生。

將PCR陽性菌落的剩余菌液接種至含有適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24H，提取質(zhì)粒做后續(xù)的鑒定。