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Alamar Blue 阿爾瑪藍(lán)

產(chǎn)品信息

檢測(cè)原理

阿爾瑪藍(lán)（Alamar Blue）是一種氧化還原指示劑，能根據(jù)代謝活性產(chǎn)生吸亮度變化和熒光信號(hào)。這是一種安全無(wú)毒的染料，可用于細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖的定量分析以及細(xì)胞因子生物測(cè)定和體外細(xì)胞毒性研究，能有效測(cè)定動(dòng)物、真菌和細(xì)菌細(xì)胞的天然代謝活性。Alamar Blue在氧化狀態(tài)下呈現(xiàn)紫藍(lán)色無(wú)熒光性，而在還原狀態(tài)下，轉(zhuǎn)變?yōu)槌史奂t或紅色熒光的還原產(chǎn)物，反映所研究的細(xì)胞或微生物對(duì)氧分子的消耗，因而常被用作氧化還原指示劑，以顯示被觀察細(xì)胞和細(xì)菌的代謝活動(dòng)。這種測(cè)定是基于具有代謝活性的細(xì)胞將試劑轉(zhuǎn)換成熒光和比色指示劑的能力。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)NADPH/NADP、FADH/FAD、FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，處于還原環(huán)境。攝入細(xì)胞內(nèi)的染料被這些代謝中間體及細(xì)胞色素類還原后釋放到細(xì)胞外并溶于培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基從無(wú)熒光的靛青藍(lán)變成有熒光的粉紅色。受損和無(wú)活性細(xì)胞具有較低的天然代謝活性，因此對(duì)應(yīng)的信號(hào)較低?？梢杂闷胀ǚ止夤舛扔?jì)或熒光光度計(jì)檢測(cè)，其激發(fā)光波長(zhǎng)在530-560 nm之間，發(fā)射光波長(zhǎng)為590 nm。吸光度和熒光強(qiáng)度與活性細(xì)胞數(shù)成正比。

本品可廣泛地用于細(xì)胞增殖代謝，藥物的細(xì)胞毒作用的體外測(cè)定以及病原微生物的的快速檢測(cè)與鑒定。 與臺(tái)盼蘭、TTC、MTT、MTS等分析法相比，Alamar Blue具有更多的優(yōu)勢(shì)。Alamar Blue采用單一試劑，可以連續(xù)、快速地檢測(cè)細(xì)胞的增生狀態(tài)。由于Alamar Blue對(duì)細(xì)胞無(wú)毒、無(wú)害，不影響細(xì)胞的抗體合成與分泌等活性，因此可以對(duì)同一批細(xì)胞的增生狀態(tài)進(jìn)行連續(xù)觀察和進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察，因此有操作簡(jiǎn)便和幾乎不干擾細(xì)胞正常代謝的特點(diǎn)。 

運(yùn)輸與保存方法

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。產(chǎn)品4oC避光保存，至少一年有效。

注意事項(xiàng)

1） 需客戶自行準(zhǔn)備100%還原型Alamar Blue試劑。為得到還原型Alamar Blue，需配制Alamar Blue與細(xì)胞培養(yǎng)基的混合溶液，Alamar Blue與細(xì)胞培養(yǎng)基的比值為1:10，高壓滅菌15min。（不能對(duì)濃縮的Alamar Blue高壓滅菌，也不能用PBS配制溶液，因?yàn)?/span>100%還原型Alamar Blue在PBS中不穩(wěn)定。）

2） 為得到的結(jié)果，建議實(shí)驗(yàn)前先摸索孵育時(shí)間和接種細(xì)胞數(shù)量。

3） 合適密度的細(xì)胞可以增加檢測(cè)靈敏度。對(duì)于96 孔板，我們建議每孔接種100 微升細(xì)胞，細(xì)胞濃度范圍為：貼壁細(xì)胞在100-10,000/孔，懸浮細(xì)胞在2,000-50,000/孔，并以培養(yǎng)基為空白對(duì)照。對(duì)于384 孔板，細(xì)胞濃度和接種量均減半。

4） 整個(gè)過(guò)程均應(yīng)為無(wú)菌操作，因?yàn)槲⑸镂廴疚锿瑯涌梢赃€原檢測(cè)試劑而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5） 注意接種細(xì)胞濃度和加入檢測(cè)試劑后孵育時(shí)間。細(xì)胞濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性還原反應(yīng)，產(chǎn)生無(wú)色和熒光消失。

6） 孵育時(shí)，須避光。

7） 本產(chǎn)品可以使用熒光或分光光度計(jì)檢測(cè)，但熒光的靈敏度高，實(shí)驗(yàn)誤差小，推薦使用熒光檢測(cè)。

操作說(shuō)明

一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測(cè)定*孵育時(shí)間和細(xì)胞數(shù)量）

1. 每孔加入100微升細(xì)胞懸液（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞），對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每個(gè)濃度建議3-6個(gè)復(fù)孔。注：設(shè)置陰性對(duì)照：細(xì)胞培養(yǎng)基中不加入細(xì)胞；陽(yáng)性對(duì)照：100微升100%還原型Alamar Blue（不含細(xì)胞）。

2. 每孔加入10微升Alamar Blue。陽(yáng)性對(duì)照孔中加入10微升無(wú)菌的超純水。

3. 放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（37℃,5% CO₂）一定時(shí)間。培養(yǎng)基的顏色由靛青藍(lán)開始變成粉紅色就可以進(jìn)入下一步。

4. 推薦用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)在530-560 nm之間，發(fā)射光波長(zhǎng)為590 nm。

5. 普通分光光度計(jì)在570nm測(cè)定吸光度，參考波長(zhǎng)600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

6. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以細(xì)胞數(shù)量或孵育時(shí)間為橫坐標(biāo)（X軸），Alamar Blue還原率為縱坐標(biāo)（Y軸）。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出適合的細(xì)胞數(shù)量或孵育時(shí)間（使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要*）。

二、細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖檢測(cè)

1. 每孔加入100微升細(xì)胞懸液（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞），對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。建議細(xì)胞數(shù)量為10⁴/ml，具體每孔需要的細(xì)胞數(shù)量，需根據(jù)細(xì)胞類型決定。

2. 細(xì)胞中加入待檢測(cè)藥物，為檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的作用，請(qǐng)?jiān)O(shè)置合適的對(duì)照組，包括刺激細(xì)胞和非刺激細(xì)胞。

3. 混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育（37℃,5% CO₂）一段時(shí)間。

4. 每孔加入10微升Alamar Blue。陽(yáng)性對(duì)照孔中加入10微升無(wú)菌的超純水。

5. 放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育（37℃,5% CO₂）4-8h，*孵育時(shí)間取決于細(xì)胞類型。培養(yǎng)基的顏色由靛青藍(lán)開始變成粉紅色就可以進(jìn)入下一步。

6. 推薦用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)在530-560 nm之間，發(fā)射光波長(zhǎng)為590 nm。

7. 普通分光光度計(jì)在570nm測(cè)定吸光度，參考波長(zhǎng)600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

活力計(jì)算                                         

1. 普通分光光度計(jì)檢測(cè)

Alamar Blue還原率（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[(E570′×C600)-E600′×C570] ×100

E570=氧化型Alamar Blue在570nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=80586；

E600=氧化型Alamar Blue在600nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=117216；

A570=檢測(cè)孔在570nm波長(zhǎng)的吸亮度；

A600=檢測(cè)孔在600nm波長(zhǎng)的吸亮度；

E570′=還原型Alamar Blue在570nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=155677；

E600′=還原型Alamar Blue在600nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=14652；

C570=陰性對(duì)照孔在570nm波長(zhǎng)的吸亮度（培養(yǎng)基，Alamar Blue，無(wú)細(xì)胞）；

C600=陰性對(duì)照孔在600nm波長(zhǎng)的吸亮度（培養(yǎng)基，Alamar Blue，無(wú)細(xì)胞）；

如果使用570/630 nm和540/600 nm作為替代，則：

E540=氧化型Alamar Blue在540nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=47619；

E630=氧化型Alamar Blue在630nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=34798；

E540′=還原型Alamar Blue在540nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=104395；

E630′=還原型Alamar Blue在630nm波長(zhǎng)的消光系數(shù)=5494；

2. 熒光分光光度計(jì)檢測(cè)

Alamar Blue還原率（％）= （實(shí)驗(yàn)組F590-陰性對(duì)照組F590）/（100%還原型陽(yáng)性對(duì)照F590-陰性對(duì)照組F590）×100

F590=590nm波長(zhǎng)熒光值