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產品簡介
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 10181ES50 | 應用領域 | 生物產業(yè) |
產品介紹
Mouse Tissue Direct PCR Kit
小鼠組織直接PCR試劑盒
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規(guī)格 | 價格（元） |
Mouse Tissue Direct PCR Kit 小鼠組織直接PCR試劑盒 | 10181ES50 | 50 T | 326.00 |
Mouse Tissue Direct PCR Kit 小鼠組織直接PCR試劑盒 | 10181ES70 | 200 T | 755.00 |
產品描述
小鼠組織直接PCR試劑盒是一款可快速對小鼠鼠尾、鼠耳、肌肉等組織樣本進行PCR擴增的試劑盒。本試劑盒采用*的裂解緩沖液體系，可以快速的裂解樣品并釋放出基因組DNA，不需要除去蛋白、RNA等，即可將釋放出的基因組DNA作為模板直接用于PCR反應。此外，樣品使用量少，低至5 mg小鼠組織或2-5 mm鼠尾即可進行實驗。
本試劑盒中提供的2× Mouse Master Mix具有很強的擴增兼容性，能直接以待測樣品裂解液為模板，進行高效特異性擴增。該試劑為2倍濃縮PCR反應混合液，包含了用于PCR擴增除模板和引物外的所有組分，大大簡化操作過程，降低污染幾率。
該試劑盒可用于轉基因型鑒定、動物基因分型等。
產品組分
類別 | 編號 | 組分 | 產品編號/規(guī)格 | 儲存 | |
10181ES50（50 T） | 10181ES70（200 T） | ||||
Part I | 10181-A | Buffer MP | 5 mL | 20 mL | 室溫或4℃ |
10181-B | Protease Plus | 220 μL | 880 μL | 4℃ | |
10181-C | 6× DNA Loading Buffera | 1.5 mL | 1.5 mL | 4℃或-20℃ | |
Part II | 10181-D | 2× Mouse Master Mixb | 500 μL | 1 mL×2 | -20℃ |
a）6× DNA Loading buffer：不含SDS。
b）2× Mouse Master Mix：包含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反應緩沖液、PCR反應增強劑、優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑等。
運輸方法
冰袋運輸。
保存方法
1. 試劑10181-A【Buffer MP】，在常溫干燥條件下，可保存12個月，如需保存更長時間可置于4℃。低溫保存，易出現(xiàn)沉淀，可平衡至室溫或37℃水浴10 min，待沉淀溶解后，混勻使用。
2. 試劑10181-B【Protease Plus】，具有*配方，為保證其更好的活性和穩(wěn)定性，建議4℃保存，切勿置于-20℃。
3. 試劑10181-C【6×DNA Loading Buffer】，可置于4℃或-20℃長期保存。
4. 試劑10181-D【2× Mouse Master Mix】，-20℃保存，避免反復凍融。
操作方法
樣品基因組DNA釋放
1. 在離心管中加入100 μL Buffer MP，4 μL Protease Plus，輕輕渦旋混勻。
【注】：Buffer MP與Protease Plus混合后盡快使用，不宜長期保存。
2. 取5-10 mg動物組織或2-5 mm鼠尾，置于上述離心管中，輕輕渦旋混勻。
【注】：組織應盡量剪碎，以便酶解反應更順利進行。
3. 65℃孵育10-30 min，然后95℃處理5 min。
【注】：65℃孵育，一般10 min即可滿足多數(shù)PCR需求。若需要的DNA量較大或樣品較難酶解，可將時間延長至30 min。組織塊不需*酶解，殘余的部分在后續(xù)離心步驟中可被除去。
4. 12000 rpm離心5 min。
5. 將上清轉移至新的離心管，4℃或-20℃保存或直接用于PCR擴增。
PCR反應鑒定——PCR反應體系
組分 | 體積（μL） | 體積（μL） | 終濃度 |
ddH2O | To 20 | To 50 | - |
2× Mouse Master Mix | 10 | 25 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
裂解產物（DNA模板） | X | X | - |
【注】：各組分使用前應充分混勻。
a）模板使用量：建議1-10%總體系，可設置梯度摸索*上樣量。模版量過多時，抑制物會顯著影響擴增效果。
b）引物終濃度：0.2-0.25 μM可以得到較好結果。反應性能較差時，可在0.1-0.5 μM范圍內調整引物濃度。
c）反應體系：推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。
d）體系配制：配制好PCR反應體系，置于渦旋儀上渦旋混勻，瞬時離心將反應液集于管底。
PCR反應鑒定——PCR反應條件
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
預變性 | 94℃ | 3 min | 1 |
變性 | 94℃ | 10 sec | 30-40 |
退火 | 50-65℃ | 20 sec | |
延伸 | 72℃ | 30 sec/kb | |
終延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
【注】：a）退火溫度：請參考引物的理論Tm值，建議退火溫度可設置高于引物理論值 2℃。
b）延伸時間：按30 sec/kb設定，如不足30 sec，設置30 sec即可。
c）擴增循環(huán)數(shù)：35個循環(huán)已可以擴增足量產物。太多的循環(huán)將會導致非特異性擴增增加。
對照反應
在PCR結果分析時，不管是陽性結果或陰性結果，如果沒有對照反應，都不能確定結果是否可靠。為了便于后續(xù)實驗結果的分析，建議在進行PCR時，設置陽性和陰性PCR對照反應以便于排除假陽性或假陰性的干擾。
注意事項
1. 為了避免樣本間交叉污染，每次取樣后都需要將取樣器材的刃口或與樣本直接接觸的部位浸入2%次氯酸鈉溶液中，反復洗刷數(shù)次進行清洗，然后用干凈的紙巾擦干殘余液體后再進行使用。為了試驗方便，也可準備多個取樣器材，在使用完后進行統(tǒng)一清洗，確保每一單獨樣本均使用的是無污染的取樣器材。
2. 建議使用新鮮采取的動物組織，若為長期冷凍組織，應盡量避免反復凍融，否則會導致模板的降解，影響PCR效率。
3. 試劑Buffer MP若低溫保存，易產生沉淀。在使用前務必將其在室溫中放置一段時間，也可在37℃水浴中預熱10 min，以溶解沉淀，混勻后再使用。
4. 建議擴增片段長度1 kb以內，以便擴增效率*。
5. 電泳檢測時，切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否則，電泳時會在泳道中出現(xiàn)一大團拖尾亮帶，影響實驗結果。
6. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
常見問題與解決方法
常見問題 | 可能原因 | 解決方法 |
陽性對照、待測樣本均無條帶。 | PCR反應體系或反應條件不合適。 | 使用梯度PCR摸索PCR*反應條件。 |
PCR試劑保存不當失去活性。 | 2× PCR Mix應保存于-20℃，使用時避免反復凍融。若使用頻繁，可在4℃短時間存放。 | |
引物設計問題。 | 嘗試重新設計引物進行檢查。 | |
陽性對照有目的條帶，待測樣本無條帶或條帶弱。 | 不當儲存或長期儲存引起試劑活性喪失。 | 使用新鮮的試劑。 |
加入組織裂解液過量。 | 增大反應體系，或減少裂解液的用量。 | |
樣本裂解混合液保存不當或保存時間過久，DNA基因組已經降解。 | 裂解混合液液可在4℃保存2-3天，盡量使用新制備的裂解液混合液進行PCR。 | |
模板加入量不適合。 | 在反應體系10-20%范圍內優(yōu)化模板加入量。反應效性能較差時，可以降模板濃度調節(jié)到低于10%的范圍。 | |
PCR循環(huán)數(shù)不足。 | 增加PCR的循環(huán)數(shù)，推薦在35-40循環(huán)為佳。因為模板復雜，PCR反應要比用純化的DNA模板多5-10個循環(huán)為佳。 | |
非特異性擴增 | PCR退火溫度太低，循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度太高。 | 增加PCR退火溫度，降低PCR循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度。 |
PCR引物錯配。 | 重新設計PCR引物。 | |
配制PCR反應體系時溫度太高或配制完成后放置時間太久。 | PCR反應體系的配制在低溫下進行，配制完成后盡快進行PCR擴增反應。 | |
陰性對照出現(xiàn)目的條帶 | 操作工具或試劑污染。 | 實驗所有試劑或器材均應高壓滅菌。操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。 |
樣本間交叉污染。 | 每個取樣器只對一個樣本使用；或取完一個樣本后，將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中，反復涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。 |
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