產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

文庫稀釋液 Library Dilution Buffer (10 mM Tris-HCl ，pH 8.0 [25℃]，0.05% Tween 20)，用于不同種類建庫試劑盒最終文庫的稀釋，請勿使用水或 TE 作為稀釋液。稀釋后的文庫和解凍后的DNA Standards（12307ES09）置于冰上存放，文庫應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)稀釋，用完丟棄。本產(chǎn)品可搭配qPCR Master Mix（Cat#12302: 包含定量所需的 qPCR Master Mix、定量擴增引物和參比染料 ROX。擴增引物根據(jù) NGS 文庫接頭序列 P5 和P7 設(shè)計，可保證特異性擴增雙端接頭完整的文庫；qPCR Master Mix 是基于抗體法熱啟動的染料法 qPCR 預(yù)混液。）使用，可對不同長度、不同 GC 或 AT 含量樣本高效、特異擴增，實現(xiàn)精確定量。

產(chǎn)品組分

運輸與保存方法

冰袋運輸。所有組分 -20℃ 保存，有效期 12 個月。

注意事項

一、關(guān)于操作

1.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2.請于使用前確保產(chǎn)品凍融和*混勻，短暫離心收集至管底后置于冰上備用。

3.為保證產(chǎn)品品質(zhì)，避免反復(fù)凍融超過 30 次！

4.為避免樣品交叉和氣溶膠污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。

5.試劑吸取時應(yīng)保證槍頭適當(dāng)深入液體，排出時應(yīng)確認槍頭無殘留。

6.為避免交叉污染，建議在不同區(qū)域分別進行模板制備、體系配制和加模板操作。

二、關(guān)于文庫稀釋

由于 DNA 在非緩沖環(huán)境中易降解，因此應(yīng)使用緩沖稀釋液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20，對應(yīng)貨號12303ES50）稀釋文庫，切勿使用水或TE作為稀釋液。測定時，文庫應(yīng)現(xiàn)測現(xiàn)稀釋，置于冰上待測，切勿使用以往配制儲存的稀釋文庫。

文庫需稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線有效 Ct 范圍內(nèi)進行定量，稀釋比例可參照過往經(jīng)驗或使用其他測定方式測定的濃度作為參考（如NanoDrop®，Qubit®或 Bioanalyzer）。使用本試劑盒可定量的文庫濃度范圍參見下表。

三、污染與陰性對照（Contamination and No-template Controls）

1.進行qPCR 實驗時，應(yīng)保證良好的實驗操作規(guī)范，以防對工作區(qū)域、試劑、耗材、儀器、DNA 標(biāo)準(zhǔn)品等造成污染。推薦將反應(yīng)體系配制區(qū)和模板制備區(qū)進行物理隔離，并定時使用 0.5% 次氯酸鈉或 10% 漂白劑對各實驗區(qū)域進行擦拭清理。

2.反應(yīng)體系配制過程中DNA Standards 的加入應(yīng)按照從低濃度至高濃度（DNA Standard 6 至 1）的順序進行，每次移液都應(yīng)更換新的槍頭，以避免氣溶膠污染。

3.每次實驗都應(yīng)平行進行NTC陰性對照反應(yīng)，配合融解曲線進行擴增特異性和體系污染程度分析。因擴增引物序列為Illumina®平臺固定序列而非 qPCR 專用引物序列，且擴增循環(huán)數(shù)較多，NTC 陰性對照反應(yīng)出現(xiàn)引物二聚體擴增進而產(chǎn)生 Ct 屬正常情況。正常情況下 Ct（NTC）> Ct （DNA Standard 6）+ 3。

使用方法

一、解凍試劑

將文庫稀釋液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0 + 0.05% Tween 20，對應(yīng)貨號12303ES50），從冰箱中拿出，置于室溫 30 min 以上。確保各試劑*解凍并*混勻，短暫離心后置于冰上備用。

二、稀釋文庫

使用文庫稀釋液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20，對應(yīng)貨號12303ES50）對待測文庫進行適當(dāng)稀釋。推薦稀釋度為1:10000-1:100000。對于高濃度文庫，可額外設(shè)置 3 個 2 倍稀釋梯度，如按 1:10000 稀釋文庫，可額外設(shè)置 1:20000，1:40000，1:80000 稀釋比例，以保證測定值在試劑盒所提供的標(biāo)曲范圍內(nèi)。

三、反應(yīng)體系配制

于反應(yīng)管中配制體系（如下表），上下顛倒或渦旋振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

注：1）每個反應(yīng)至少設(shè)置 3 個平行；2）推薦進行 20 μL 反應(yīng)體系，如需進行 10 μL 反應(yīng)，則將體系各組分等比減少；3）*在陰性對照反應(yīng)管中加入ddH2O；在樣品反應(yīng)管中加入稀釋后的文庫；在標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)管中加入DNA Standards；4）根據(jù)儀器選擇合適的ROX，推薦使用量為 0.5 μL。

四、qPCR 運行程序

將反應(yīng)管置于 qPCR 儀中，按下述條件（如下表）設(shè)置 qPCR 反應(yīng)程序，并運行（熔解曲線可根據(jù)儀器默認即可）。

注：*若文庫平均長度超過600 bp，應(yīng)將退火延伸時間由45 sec延長至90 sec。

五、數(shù)據(jù)分析

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

1)根據(jù)復(fù)孔間 Ct 差異≤0.2 的原則，對 DNA Standards 原始 Ct 進行過濾，并計算平均 Ct。

2)使用有效范圍內(nèi)的 Ct（作為縱坐標(biāo)）和 Log[pM]（作為橫坐標(biāo)）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照 NTC 陰性對照 Ct 確認標(biāo)準(zhǔn)曲線 Ct有效范圍。

若 Ct (NTC) > Ct（DNA Standard 6）+ 3，則最大有效 Ct 為 Ct（DNA Standard 6），應(yīng)使用 DNA Standard 1-6 所產(chǎn)生的 Ct 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

若Ct（DNA Standard 6）+ 3 > Ct (NTC) > Ct （DNA Standard 5）+ 3，則最大有效 Ct 為Ct （DNA Standard 5），應(yīng)使用 DNA Standard 1-5 所產(chǎn)生的 Ct 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

若Ct（DNA Standard 5）+ 3 > Ct （NTC）> Ct（DNA Standard 4）+ 3，則最大有效 Ct 為Ct（DNA Standard 4），應(yīng)使用 DNA Standard 1-4 所產(chǎn)生的 Ct 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

基于定量準(zhǔn)確性考慮，請至少使用 4 個 Ct（DNA Standards）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。若 Ct （DNA Standard 4）+ 3 > Ct （NTC），提示定量體系存在嚴(yán)重污染，需更換體系中所有組分后重復(fù)試驗。

3)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù) R2 應(yīng)不低于 0.99，斜率應(yīng)位于 -3.1 至 -3.6 之間（表示擴增效率位于 90%-110% 之間）。如標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)不佳，應(yīng)重復(fù)試驗。

2.文庫長度矯正

稀釋文庫的 Ct 只有位于標(biāo)準(zhǔn)曲線有效 Ct 范圍之內(nèi)才可用于濃度計算，同時應(yīng)對文庫進行長度矯正?？筛鶕?jù)下述公式計算原始文庫濃度（nM）：

原始文庫濃度（nM）= [450 bp /文庫平均長度（bp）] × 稀釋文庫的濃度（pM）× 稀釋倍數(shù)/1000

六、使用案例

用 Hieff NGS® DNA Library Quantification Kit for Illumina®定量嗜鹽桿菌基因組 DNA 文庫，文庫 GC 含量為 70%，長度450 bp。將文庫稀釋 10000 倍上機檢測，結(jié)果如下圖所示。根據(jù)標(biāo)曲及公式，文庫終濃度=4.37 pM × 稀釋倍數(shù) 10000=43.7 nM。

HB210510