1、蛋白樣品不能反復(fù)凍融；

2、蛋白樣品應(yīng)加蛋白酶抑制劑，以增加蛋白的穩(wěn)定性；

3、細(xì)胞水平要做 Western Blot，一般地 5×10⁶ 個細(xì)胞提取的蛋白夠就足 Western Blot；

4、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，建議提取后hao加上 NaF 去抑制磷酸化酶的活性；

5、若轉(zhuǎn)膜不*，可以加大上樣量，還有轉(zhuǎn)移時你可以用降低電流延長時間，轉(zhuǎn)膜液中甲醇的比例多加 5－10％；

6、如果上樣量超載，可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載 30％是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試 1.5mm 的 comb；

7、蛋白變性后，－80℃，一兩年沒有問題。關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)；

8、脫脂奶粉中含生物素，如果實驗中有涉及到“生物素”請將封閉液改為 BSA 封閉；

9、做 200kd 以上蛋白的 Western Blot 時要注意，分離膠hao選擇>7%的；剝膠時要小心；轉(zhuǎn)移時間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）；

10、蛋白的上樣量要根據(jù)實驗的要求來定，如果要求是定量和半定量的 Western Blot 則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒有太大的關(guān)系，盡量多上就行了，但是不要超過 0.3μg/mm2；

11、一抗，二抗的比例是比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底；

12、免疫組化和 Western Blot 可以用同一種抗體嗎？

免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和 Western，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間。（限于單抗）；

13、抗體工作溶液一般不主張儲存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用 2－3 次。稀釋后應(yīng)在 2－3 天內(nèi)使用，4 度保存，避免反復(fù)凍融；

14、NC 膜 PVDF 膜 尼龍膜的差異。

尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應(yīng)用zui廣的一種固相支持物，價格*；PVDF 膜介于二者之間。

就結(jié)合能力而言： 尼龍膜結(jié)合 DNA 和 RNA 能力可達(dá) 480－600μg/cm²，可結(jié)合短至 10bp 的核酸片段；硝酸纖維素膜結(jié)合 DNA 和 RNA 能力可達(dá) 80－100μg/cm²，對于 200bp 的核酸片段結(jié)合能力不強；PVDF 膜結(jié)合 DNA 和 RNA 能力可達(dá) 125－300μg/cm²。

就溫度適應(yīng)性而言：尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合 DNA，結(jié)合不牢固；PVDF 膜結(jié)合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。

就韌性而言：尼龍膜較強；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF 膜較強。

就重復(fù)性而言：尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交，雜交后，探針分子可經(jīng)堿變性被洗脫下來；硝酸纖維素膜不能重復(fù)使用；PVDF 膜可以重復(fù)使用。

15、在做 Western Blot 時，PVDF 膜用甲醇浸泡的目的。

PVDF 膜用甲醇泡的目的是為了活化 PVDF 膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。

16、膜、濾紙、膠大小有何講究？

如果用的是半干法，順序為：陰極－濾紙－膠－膜－濾紙。濾紙的長寬分別比膠面小 1－2mm，而膜的長寬分別比膠大 1－2mm。

禁忌：上下兩層濾紙因為過大而相互接觸，這樣會短路，電流不會通過膠和濾紙。

17、電泳時 Marker 總跑不全所有條帶，即使用增大膠濃度仍不全？

檢查兩種緩沖液 Tris-HCl（pH 8.8 和 pH 6.8），有可能有長菌現(xiàn)現(xiàn)象，建議重配兩種緩沖液。

18、Western Blot 染色的選擇

（1）陰離子染料是zui常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達(dá)到 1.5μg，考馬斯亮藍(lán)雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅 S 和快綠在檢測后容易從蛋白質(zhì)中除去 ，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。

缺點是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞。不能用于正電荷的膜。靈敏度低。

（2）膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到 pg 級，但染色不穩(wěn)定。

（3）生物素化靈敏度位于 1、2 之間，可用于任何一種膜。

19、轉(zhuǎn)膜液加甲醇的目的是什么？

加甲醇起著一定的固定作用，因為小分子蛋白質(zhì)容易轉(zhuǎn)出去.(特別是在硝酸纖維素膜上，因為 NC 膜結(jié)合蛋白質(zhì)的能力較弱)。

20、轉(zhuǎn)膜時何為濕法，何為半干法？

半干法和濕法轉(zhuǎn)移是兩種不同的轉(zhuǎn)移裝置下的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，將膜，膠，濾紙整個浸泡在 buffer 的 Tank 里轉(zhuǎn)移的，叫濕法；用濾紙吸 buffer 來做轉(zhuǎn)移體系的叫半干法。

21、為什么濃縮膠和分離膠的電壓不一致？同樣的電壓可以嗎？

濃縮膠的目的使得 loading 的樣品能夠在同一條水平線上進(jìn)入分離膠 ，如果電壓太大前端的蛋白容易在后面的蛋白趕上來前進(jìn)入分離膠。

而在分離的理論上（實際上也是）小電壓長時間分離的效果會更好，但是在操作過程中沒有必要等那么長的時間，所以就用大電壓快點跑。